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人原代肝細胞(Primary human hepatocytes, PHH)一直被視為毒理學(xué)領(lǐng)域中先進的體外人體肝臟模型系統(tǒng)。然而，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法對這些細胞的轉(zhuǎn)染性研究一直具有挑戰(zhàn)性。且隨著培養(yǎng)過程的展開，PHH往往會快速失去其典型的肝功能，這限制了進一步研究的深入。Lonza帶來的新研究旨在優(yōu)化冷凍保存的PHH的解凍、轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)程序，以期能夠持續(xù)保持其穩(wěn)定性和肝細胞功能。研究中對轉(zhuǎn)染7天后的肝臟細胞進行了轉(zhuǎn)染效率和肝細胞功能的綜合分析，以分析這一優(yōu)化過程的成效。
那么就讓我們來看看具體用到了哪些設(shè)備與程序，以及這7天的報告[1]吧!
01
設(shè)備
· 4D Nucleofector™ Core unit(Catalog# AAF-1003B, Lonza)
· 4D Nucleofector™ X unit(Catalog# AAF-1003X, Lonza)
02
試劑
· Cryopreserved Primary Human Hepatocytes(Catalog# HUCPI, Lonza)
· Hepatocyte culture media: HCM Bullet Kit(Catalog# CC-3198, Lonza)
· P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit L(Catalog# V4XP-3024, Lonza)
· Matrigel(Corning)
· Cleancap mCherry RNA(TriLink)
· CellTiter-Blue Cell Viability Assay(Promega)
· Human Albumin ELISA Kit(Bethyl)
· Cholyl-lysyl-flurescein(CLF) staining(Corning)
03
結(jié)果
使用EX-147程序，觀察到高達68%的DNA轉(zhuǎn)染效率。白蛋白分泌和細胞色素p450活性在轉(zhuǎn)染后24小時明顯可檢測到，但部分不能持續(xù)較長時間(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們推薦EX147程序用于高效的短期DNA轉(zhuǎn)染。
使用DS-150程序，DNA的效率高達20%，mRNA的效率高達85%，并持續(xù)7天。轉(zhuǎn)染后24h細胞活力和白蛋白分泌略有下降，但隨著時間的推移逐漸恢復(fù)。與對照培養(yǎng)相比，CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4活性在60%至80%之間。轉(zhuǎn)染的PHH形成復(fù)雜的、分支的膽管網(wǎng)絡(luò)。我們推薦DS-150程序，用于siRNA和mRNA的高效轉(zhuǎn)染，以及轉(zhuǎn)染后長期培養(yǎng)的中等水平DNA轉(zhuǎn)染。
04
結(jié)論
我們提出了在冷凍保存的PHH中高效表達DNA和mRNA的研究方案。通過Lonza的研究表明，使用DS-150方案后，轉(zhuǎn)染肝細胞的功能可高度保存7天。這一方案有助于使轉(zhuǎn)染人肝細胞能夠產(chǎn)生更復(fù)雜的長期體外肝臟模型。
