細胞復蘇操作

• 準備培養基和耗材 ：準備適合細胞生長的培養基，如 DMEM 高糖培養基，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素混合液。同時準備好培養瓶、離心管、吸管等耗材，并確保所有器材均經過無菌處理。

• 取出凍存細胞 ：從液氮罐或 - 130°C 以下的保存環境中取出凍存的細胞，迅速放入 37°C 水浴中快速解凍，輕輕搖晃使其均勻受熱，直到凍存管內的干冰全溶解。

• 細胞處理與培養 ：將解凍后的細胞懸液轉移至離心管中，加入適量的培養基輕輕吹打混勻，然后進行離心，去除凍存液。再用新鮮培養基重懸細胞，將其接種到預先準備好的培養瓶中，輕輕搖晃使細胞均勻分布，放入 37.0°C、5% CO? 的培養箱中進行培養。

細胞傳代操作

• 觀察細胞狀態 ：在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態和密度，當細胞生長至培養瓶壁的 80%-90% 時，即可進行傳代操作。

• 細胞消化與收集 ：棄去培養瓶中的舊培養基，加入適量的 PBS 清洗細胞，去除殘留的培養基和雜質。加入胰蛋白酶消化液，在 37°C 下孵育 1-2 分鐘，觀察細胞是否從瓶壁脫落。當細胞大部分脫落后，加入含血清的培養基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，使其分散成單個細胞或小細胞團，然后將細胞懸液轉移至離心管中，進行離心收集細胞。

• 細胞計數與接種 ：對離心后的細胞進行計數，根據需要的傳代比例，將細胞懸液按適當的比例接種到新的培養瓶中，加入新鮮的培養基，輕輕搖晃培養瓶使細胞均勻分布，放入培養箱中繼續培養。

細胞凍存操作

• 準備凍存液和凍存管 ：凍存液一般由基礎培養基、胎牛血清和 DMSO 按一定比例配制而成，如含 90% 胎牛血清和 10% DMSO 的凍存液。準備好標記好細胞名稱、凍存日期等信息的凍存管。

• 細胞收集與處理 ：將培養好的細胞用胰蛋白酶消化并收集，離心去除培養基和消化液，用凍存液重懸細胞，調整細胞密度至適當濃度，一般為 1×10^6 cells/ml 左右。

• 細胞分裝與凍存 ：將細胞懸液分裝到凍存管中，每管 1-2ml。將凍存管放入 - 80°C 冰箱中預凍 2-4 小時，然后轉移到液氮罐中長期保存。在凍存過程中，要盡量保持溫度的均勻下降，以減少細胞內冰晶的形成對細胞的損傷。

培養基的配方與優化

• 基礎配方 ：常用的培養基為 DMEM 高糖培養基，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素混合液。此外，還可以根據細胞的具體需求添加其他生長因子和營養成分，如神經生長因子、胰島素等，以促進細胞的生長和增殖。

• 優化方法 ：在細胞培養過程中，可以根據細胞的生長狀態和實驗需求對培養基進行優化。例如，如果細胞生長緩慢，可以適當增加胎牛血清的含量；如果細胞容易發生凋亡，可以添加一些抗凋亡因子，如 Bcl-2 等。

培養條件的控制

• 溫度和氣體條件 ：永生化大鼠中腦(AF5)細胞系- SV40T (T155g) 通常在 37.0°C、5% CO? 的培養箱中進行培養。溫度和 CO? 濃度的穩定對于維持細胞的正常生長和代謝非常重要。CO? 的作用是維持培養基的 pH 值，如果 CO? 濃度過高或過低，都會導致培養基的 pH 值發生變化，從而影響細胞的生長。

• 濕度控制 ：培養箱內的濕度也應保持在適當的水平，一般要求濕度在 95% 以上。可以通過在培養箱內放置水盤或使用加濕器來增加濕度。濕度不足會導致培養基中的水分蒸發，使培養基的體積減少，濃度升高，從而影響細胞的生長。

細胞污染的預防與處理

• 預防措施 ：在細胞培養過程中，應嚴格遵守無菌操作規程，避免細胞受到污染。所有與細胞接觸的器材和試劑都應經過無菌處理，如高壓滅菌、過濾除菌等。操作人員應戴口罩、手套，避免皮膚和呼吸道的微生物接觸到細胞。

• 污染檢測與處理 ：定期檢查細胞的生長狀態，觀察是否有細菌、真菌或支原體等污染跡象。如果發現細胞培養液變渾濁、細胞表面有菌斑或細胞形態發生異常變化，應及時進行污染檢測。一旦確認細胞受到污染，應立即采取措施進行處理，如使用抗生素、抗真菌藥物等，但要注意藥物的使用濃度和時間，以免對細胞造成毒性作用。