破骨細胞培養操作方法

1. 使用raw細胞：

（1） 先消化，按96孔板 每孔5000-10000（具體的密度要自己摸）鋪板。

（2）第二天開始誘導，用10%血清α-men 50ng/ml的rankl誘導，直至出破骨。Raw比較難。 

2. 使用原代細胞：

小鼠后肢股骨脛骨的骨髓沖出細胞打散，用10%FBS的α-men  （20ng/ml  mcsf）養5天，第三天的時候換液。5天后鋪板。

按96孔板每孔8000-10000鋪板，第二天開始誘導，用10%血清α-men 20ng/ml的mcsf 50ng/ml的rankl 誘導。原代多個mcsf 并且要多養5天的原代。

破骨細胞培養問答：

Q1: 我想用小鼠的骨髓來源的巨噬細胞做實驗，但是巨噬細胞很難消化，這個問題怎么解決？

A1:  PBS沖洗，加胰酶消化（8分鐘左右，觀察后再決定是否需要更久）；加培養基中和，用移液槍反復吹，使細胞脫板，離心，培養基重懸，然后鋪板加rankl誘導。

Q2：破骨細胞誘導分化的過程中，加入了m-csf和rankel，需要養多久？中間需要換液嗎，換液的頻率是什么樣的？

A2：培養基2天一換，一般4天出細胞，不行再養6-8天。細胞密度要控制好，96孔板8000－10000，六孔板20萬，其他孔板按照這個密度來算就行了。

Q3：骨吸收觀察方法有哪些：

A3： （1）甲苯胺藍（2）電鏡評估，（3）破骨細胞f-actin ring免疫熒光。

 電鏡的話不用甲苯胺藍，直接細胞洗掉去拍就行了。 熒光普通的方法染，用actin 抗體 ，細胞膜就染上了