實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)服務(wù)

【星森林生物】提供快捷高效的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time PCR,RT PCR)服務(wù)，所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 是一個(gè)常用的mRNA水平的基因表達(dá)定量技術(shù)。

服務(wù)內(nèi)容

細(xì)胞/組織的基因差異表達(dá)檢測(cè)，經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等)，特定基 因在不同時(shí)段的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證。

 組織/細(xì)胞樣品中基因拷貝數(shù)的確定，DNA或RNA的相對(duì)和絕dui定量分析。

包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植 物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi基因失活率的檢測(cè)等。

基因分型，基因突變及多態(tài)性方面的研究。

技術(shù)原理

Real-time PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線 對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和 標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)，有效解決了PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，做到PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè) 數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定Ct值，從而根據(jù)Ct值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。

技術(shù)流程

一、RNA的提取

二、DNase I 消化樣品RNA 中的DNA

三、RNA瓊脂糖凝膠電泳

四、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA Real-Time PCR引物設(shè)計(jì)的要求

① Tm=55~65 ℃

② GC=30~80%

③ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80~300 bp之間都可。 ④ 引物的退火溫度要高，一般要在60 ℃以上。

五、cDNA與引物質(zhì)量檢測(cè)

選擇特異性好，擴(kuò)增效率高的引物作為實(shí)時(shí)熒光使用引物。

六、利用相對(duì)定量的方法分析目的基因表達(dá)量的情況：

常用的看家基因有β-actin，GAPDH，18S rRNA

七、定量PCR檢測(cè)

八、擴(kuò)增曲線和溶解曲線

溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴(kuò)增，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平 臺(tái)期。

歡迎咨詢?cè)斦劊覀儠?huì)根據(jù)您的方案及需求制定詳細(xì)的服務(wù)協(xié)議。

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