Mouse Airway Organoid Kit Plus

小鼠氣管類器官培養基套裝Plus

1、 產品描述

模基生物小鼠氣管類器官培養基套裝Plus（Mouse Airway Organoid Kit Plus）是一種化學定義的細胞培養基，用于建立和維持從小鼠氣道干細胞衍生的小鼠氣道器官。氣道上皮的自我更新由基底干細胞的增殖驅動。小鼠氣道器官包含基底細胞、纖毛細胞、分泌細胞和少量神經內分泌細胞，因此器官顯示出在體系結構、細胞類型組成和自我更新動力學方面與氣道上皮的所有特征，因此對于氣道發育和疾病研究具有巨大的潛力。

2、 產品信息

3、 其他自備試劑和耗材

4、 小鼠氣管類器官培養基使用說明

1、   收到類器官培養基后，將培養基置于4℃冰箱進行解凍；

2、   待培養基解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺中根據日常需求量進行分裝，推薦分裝成10mL/管；

3、   分裝后的培養基請密封后儲存于-20℃，使用時取出分裝的培養基放置室溫平衡后即可使用。

5、 小鼠氣管類器官的建立與傳代培養

a)     原代小鼠氣管類器官的建立

1、   實驗前先將基質膠放置4℃冰上解凍，同時取出培養基放置室溫平衡。與細胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養防粘附潤洗液潤洗后使用。

2、   取樣：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌條件下取出小鼠氣管組織，放入4℃預冷的上皮類器官基礎培養基或含雙抗的DPBS中，清洗組織2次。

3、   使用鑷子將組織轉移至1.5mL離心管中，在冰上用無菌的將碎為0.5~2mm2大小。

4、   將剪碎的組織用50倍組織體積的重懸，并轉移至15mL離心管內，吹打重懸組織塊。于37℃，100rpm條件下的恒溫搖床中，水平振蕩消化30分鐘，每隔10分鐘觀察組織消化情況，待組織塊明顯分散，懸液較渾濁時，取適量組織消化懸液鏡檢，待懸液中有較多活細胞團即可終止消化，若組織碎塊較大或消化不可適當延長消化時間。消化期間可以使用不同規格（順序從大到小如10mL、5mL、1mL）的移液管吹打組織消化懸液，幫助充分消化。當大多數組織片段能夠通過1mL移液器吸頭時，消化過程即完成。

5、   將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，并使用100μm細胞過濾器過濾。

6、   收集濾液并在4℃下以250g離心3分鐘。在可見的紅色沉淀的情況下，吸棄上清液，加入2mL紅細胞裂解液重懸沉淀，在室溫下裂解紅細胞1分鐘，并在4℃下以250g離心3分鐘。

7、   吸棄上清液并將沉淀重懸于上皮類器官基礎培養基中，在4℃下以250g離心3分鐘，再次重復此步驟以去除消化液和FBS，在離心前可取適量的懸液進行細胞活性檢測。

8、   吸棄上清液，根據培養需求取適量細胞沉淀加入基質膠（>70%）并在冰上混勻（

注意：混勻吹打的動作要輕柔，切忌產生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內），混勻后置于冰上。

注意：基質膠應保存在冰上以防止其凝固。盡快進行該過程。大約10,000個細胞應接種在25μL基質膠中。不要過度稀釋基質膠（基質膠比例應>70%（基質膠體積/總體積）），因為這可能會抑制固體液滴的正確形成。

9、   將基質膠和細胞的混合懸液點入培養孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。

注意：一旦類器官重懸于基質膠中，盡快進行種板，因為基質膠可能會在試管或移液器吸頭中凝固。

10、 將培養板放入37℃和5%CO?的培養箱中15-25分鐘，讓基質膠凝固。

11、 待基質膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官培養基，避免破壞已凝固結構。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養基直接添加到基質膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結構。

12、 將培養板置于37℃和5%CO?的恒溫培養箱中。

13、 每隔2~3天更換一次培養基，小心地從孔中吸出培養基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官培養基。

14、 密切監測類器官生長狀態，理想情況下，小鼠氣道類器官應在7-14天內建成。

b)      小鼠氣管類器官的傳代培養

1、   待類器官培養到直徑為100~500μm大小時（或變黑不再增大時），即可進行類器官的傳代（每代約1~2周）。以下操作與細胞接觸的耗材均需用潤洗液潤洗后使用：

2、   吸棄舊培養基，加入等體積上皮類器官基礎培養基，用細胞刮刀或者移液管吸頭輕輕刮下（或吹打）基質膠和類器官混合物，轉移至1.5mL離心管中（每管最多收集2~3孔類器官，避免體積體積過大消化效率低），吹打5~10次，使類器官和基質膠分離，300g離心3分鐘。

3、   去除上清液加入5倍于基質膠和類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養箱中消化5~10分鐘。取出吹打混勻，取10μL混合液鏡檢是否消化成小的細胞團塊，消化不充分可適當延長消化時間。若要求細胞計數則需消化成單個細胞，可延長消化時間至10~20分鐘后終止消化后臺盼藍染色進行細胞計數。密切監視消化過程使在類器官解離液中的孵育時間最短。

4、   消化完成后，加入5倍體積上皮類器官基礎培養基吹打混勻以終止消化反應，然后250g離心3分鐘。

5、   吸棄上清液，用上皮類器官基礎培養基清洗2次以去除殘留的消化液。次清洗可將類器官合并收集在同一個離心管中。

6、   清洗完成后將離心沉淀中的細胞進行傳代培養，在細胞沉淀中加入基質膠（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動作要輕柔，切忌產生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內），混勻后置于冰上。

注意：基質膠稀釋比例應在70%以上以保證培養過程中基質膠的結構穩定性。

7、   將基質膠和細胞的混合懸液點入培養孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。

注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

8、   將培養板放入37℃和5%CO?的培養箱中15-25分鐘，讓基質膠凝固。

9、   待基質膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官培養基，避免破壞已凝固結構。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。

注：不要將培養基直接添加到基質膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結構。

10、 將培養板置于37℃和5%CO?的恒溫培養箱中。

11、 每隔2~3天更換一次培養基，小心地從孔中吸出培養基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官培養基。

12、 密切監測類器官生長狀態，直到類器官需要進行下一步實驗。

V2.0版

更新時間：2025/6/20