Human Colonic Organoid Kit Plus（Differentiation）

人結(jié)腸類器官培養(yǎng)基套裝（分化）Plus

1、 產(chǎn)品描述

模基生物人結(jié)腸類器官培養(yǎng)基套裝（分化）【Human Colonic Organoid Kit Plus (Differentiation) 】是一款用于人結(jié)腸類器官分化的培養(yǎng)基。在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)環(huán)境下，人結(jié)腸類器官中的結(jié)腸干細胞和祖細胞逐漸分化為不同類型的細胞，如吸收細胞、分泌細胞、杯狀細胞等。這個分化過程對于研究結(jié)腸的發(fā)育、生理功能以及相關(guān)疾病的發(fā)生機制具有重要價值。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備試劑和耗材

4、 人結(jié)腸類器官培養(yǎng)基（分化）使用說明

1、   收到類器官培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基置于4℃冰箱進行解凍；

2、   待培養(yǎng)基解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺中根據(jù)日常需求量進行分裝，推薦分裝成10ml/管；

3、   分裝后的培養(yǎng)基請密封后儲存于-20℃，使用時取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。

5、 人結(jié)腸類器官的分化培養(yǎng)

人結(jié)腸類器官分化培養(yǎng)前需要經(jīng)過原代建立擴增培養(yǎng)或者傳代擴增培養(yǎng)至類器官大小為600μm以上，如下圖：

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)的機構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

a)     原代人結(jié)腸類器官的建立

1、   原代組織樣本應(yīng)在離體5min內(nèi)放入裝有預(yù)冷的活組織保存液（2-8℃）的樣本管中，樣本需要被活組織保存液覆蓋（如果樣品已經(jīng)放在其他緩沖液或培養(yǎng)基中，請用預(yù)冷的活組織保存液替換整個溶液）。低溫（2~8℃）運輸轉(zhuǎn)移至實驗室。

2、   實驗前先將基質(zhì)膠放置4℃冰上解凍，同時取出培養(yǎng)基放置室溫平衡。與細胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養(yǎng)防粘附潤洗液潤洗后使用。

3、   在潔凈工作臺中，將樣本轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，評估獲得的組織是否由上皮組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請在解剖顯微鏡下使用刀或和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請立即繼續(xù)下一步。

4、   將組織樣本轉(zhuǎn)移至裝有預(yù)冷含雙抗DPBS的培養(yǎng)皿中，腸腔面朝上，一只手使用夾住腸組織一端，另一只手使用片輕輕刮去腸腔表面粘液或殘留的糞便，接著將結(jié)腸組織置于新的含雙抗DPBS的培養(yǎng)皿中清洗2-3次。將清洗后的腸碎至約2mm*5mm大小，隨后轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，劇烈震蕩30s(垂直上下震蕩20次一上一下算一次，約1s三次)棄上清，重復(fù)3次。

5、   消化：加入30mL的DPBS溶液中再加入300μL 0.5M EDTA，至EDTA終濃度為5mM。置4℃搖床上，80rpm，消化20~30min（視樣本量而定，可在消化20分鐘時吹打混勻后鏡下觀察消化情況，若觀察到完整的隱窩結(jié)構(gòu)即可進行下一步操作）。

6、   清洗：消化完成后，靜置待腸段沉淀，棄上清。加入預(yù)冷DPBS，輕柔搖勻，靜置后棄上清，重復(fù)2次以去除EDTA。

7、   重懸：加入30mL預(yù)冷的含0.1%BSA的DPBS，渦旋10s，取上清100μm濾網(wǎng)過濾，收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液，重復(fù)收集2次。

8、   收集：300g離心力4℃離心3min。

9、   吸棄上清液并將沉淀重懸于上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，取懸液進行隱窩計數(shù)。

10、 300g離心力4℃離心3min，吸棄上清液，根據(jù)培養(yǎng)需求取適量細胞沉淀加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意：混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注：基質(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止其凝固。盡快進行該過程。大約50個隱窩應(yīng)接種在25μL基質(zhì)膠中。不要過度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠比例應(yīng)>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因為這可能會抑制固體液滴的正確形成。

11、 將基質(zhì)膠和細胞的混合懸液點入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。

注意：一旦類器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進行種板，因為基質(zhì)膠可能會在試管或移液器吸頭中凝固。

12、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

13、 待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。

注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

14、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。

15、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官培養(yǎng)基。

16、 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)。

b)      人結(jié)腸類器官的傳代培養(yǎng)

1、   待類器官培養(yǎng)到直徑為600μm大小時（或變黑不再增大時），即可進行類器官的傳代（每代約1周）。以下操作與細胞接觸的耗材均需用潤洗液潤洗后使用：

2、   吸棄舊培養(yǎng)基，加入等體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用細胞刮刀或者移液管吸頭輕輕刮下（或吹打）基質(zhì)膠和類器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中（每管最多收集2~3孔類器官，避免體積體積過大消化效率低），吹打5~10次，使類器官和基質(zhì)膠分離，300g離心3分鐘。

3、   去除上清液加入5倍于基質(zhì)膠和類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化3分鐘。取出吹打混勻，取10μL混合液鏡檢是否消化成300μm左右類器官團塊。

注：一下步驟重懸沉淀需要控制吹打力度及次數(shù)，是類器官團塊控制在大小300μm左右。

4、   消化完成后，加入5倍體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基輕柔吹打混勻以終止消化反應(yīng)，然后250g離心3分鐘。

5、   吸棄上清液，用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次以去除殘留的消化液。次清洗可將類器官合并收集在同一個離心管中。

6、   清洗完成后將離心沉淀中的細胞進行傳代培養(yǎng)，在細胞沉淀中加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7、   將基質(zhì)膠和細胞的混合懸液點入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。大約50個類器官團塊接種在25μL基質(zhì)膠中。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8、   將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

9、   待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

10、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。

11、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官培養(yǎng)基。

12、 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，直到類器官需要進行下一步實驗。

V2.0版

更新時間：2025/6/12