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RNA評價與鑒定

閱讀:8730      發布時間:2010-1-26
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RNA評價與鑒定
提取得到RNA溶液后,我們需要對RNA進行相關的質量檢測,以確
定它是否符合后續實驗的要求。RNA用于不同的后續實驗,對其質
量要求不盡相同。cDNA文庫構建要求RNA完整且無酶等抑制物殘
留;Northern blot實驗對RNA完整性要求較高,對酶反應抑制物殘
留要求較低;RT-PCR實驗對RNA完整性要求不太高,但對酶反應
抑制物殘留要求嚴格。因此在進行不同的實驗時應選擇不同的方法
純化RNA,以達到佳的實驗效果。
RNA得率檢測——分光光度計法
RNA得率有很強的組織特異性,不同組織RNA的豐度和RNA提取的
難易程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來說,可通過分光
光度計測定RNA溶液在260nm處的吸光值來計算RNA的含量。RNA
溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液
渾濁度、雜質(多肽、苯酚等)濃度和蛋白等有機物的吸收值。用標
準樣品測得在波長260nm處,1μg/ml RNA鈉鹽吸光度為0.025(光
程為1cm),即OD260=1時,樣品中RNA濃度為40μg/ml。通常分光
光度計OD260的讀數要介于0.15-1.0之間才是可靠的,因此RNA提
取結束后,要根據大概產量稀釋到適當濃度范圍,再用分光光度計
檢測。按下面的公式計算總RNA濃度:
總RNA濃度(μg/ml)= OD260×稀釋倍數× 40μg/ml
RNA純度檢測——分光光度計法
通過OD260/280來檢測RNA純度,OD260/230作為參考值。
OD260/280在1.9-2.1之間,可以認為RNA的純度較好;
OD260/280值小于1.8,則表明蛋白雜質較多;
OD260/280值大于2.2,則表明RNA已經降解;
OD260/230值小于2.0,則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙
醇殘留。
注意:如果用TE溶解或洗脫RNA,會使OD260/280值偏大。
RNA完整性鑒定——瓊脂糖凝膠電泳
變性電泳:
我們可以通過RNA變性電泳,來鑒定RNA的完整性,但一般情況
下常規電泳檢測即可。
RNA變性電泳方法如下:
1、凝膠制備:1.2%瓊脂糖凝膠
2、上樣電泳
①電泳混合液的制備:
10×甲醛變性電泳緩沖液 1.25ul
37%甲醛 2.2ul
甲酰胺 6.25ul
②加入RNA
③混合后1000-2000rpm離心5-10秒
④55℃加熱15分鐘
⑤加入2.5 μ l甲醛凝膠上樣緩沖液,混合后離心5秒
⑥將樣品加入點樣孔
⑦在5 V/cm的電壓下電泳至溴酚藍帶跑到電泳槽中央(20cm長電
泳槽,95V電壓,1小時左右)。
rRNA占總RNA的80-85%,在瓊脂糖凝膠上可以清晰地看到
28S(23S)和18S(16S)rRNA。如28S rRNA的量約為18S rRNA的兩
倍,說明RNA完整性較好。
常規電泳:
由于變性電泳操作步驟較為復雜,所以在要求不太嚴格的實驗
中,RNA的檢測可以通過常規的瓊脂糖凝膠電泳進行。一般1%
左右的凝膠就可以。按常規電泳配制好凝膠和電泳溶液,總RNA
在普通瓊脂糖凝膠電泳上顯示條帶與變性電泳一致。

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