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幾種蛋白質(zhì)含量測量方法比較
幾種蛋白質(zhì)含量測量方法比較
蛋白質(zhì)含量測定一直是生物化學(xué)中zui常用、zui基本的分析方法之一。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。機體每個系統(tǒng)都有蛋白質(zhì)的參與，蛋白質(zhì)占人體重量的16.3%。人體的蛋白質(zhì)主要來源于食物：豆制品、肉類或者奶粉等副食品。既然蛋白質(zhì)都來自于食物，那么測定食物中的蛋白質(zhì)含量就變得很有必要。
蛋白質(zhì)含量測定有好多種方法，歸納起來為：凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍法。不同的方法，原理、步驟和實驗試劑都各不相同，但是一直以來，凱氏定氮法zui為經(jīng)典，使用。近幾年，根據(jù)蛋白質(zhì)測定的凱氏定氮法，很多廠家已研制出了相應(yīng)的儀器，如：蛋白質(zhì)測定儀。蛋白質(zhì)測定儀測出的蛋白質(zhì)含量，包括其他非蛋白含氮化合物，如游離氨基酸、尿素等物質(zhì)，因此該儀器有時又被叫做粗蛋白測定儀。
下面我們列表來對各種蛋白質(zhì)含量測定方法進行比較。
| 方法 | 靈敏度 | 時間 | 原理 | 干擾物質(zhì) | 說明 |
| 凱氏定氮法 | 靈敏度低，使用于0.2-1.0mg氮，誤差為±2% | 費時，8-10小時，但如果采用凱氏定氮儀，縮短時間至4個小時 | 將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨氣，然后用酸吸收滴定 | 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） | 用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定，干擾少，如果采用凱氏定氮儀，就會大大縮短定氮時間 |
| 雙縮尿法 | 靈敏度低，1-20mg | 中速20-30分鐘 | 多肽鍵+堿性Cu2+紫色絡(luò)合物 | 硫酸銨：Tris緩沖液，某些氨基酸 | 用于快速測定，但不靈敏，不同蛋白質(zhì)顯色相似 |
| Folin酚試劑法 | 靈敏度高，<5微克 | 慢速40-60分鐘 | 雙縮尿反應(yīng)，磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 | 硫酸銨，Tris緩沖液，甘氨酸，各種硫醇 | 耗費時間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 |
| 紫外吸收法 | 較為靈敏，50-100微克 | 快速5-10分鐘 | 蛋白質(zhì)中的絡(luò)氨酸和色氨酸殘基在280nm處德光吸收 | 各種嘌呤和各種核苷酸 | 用于層析柱流出液的檢測，核酸的吸收可以校正 |
| 考馬斯亮藍法 | 靈敏度zui高，1-5微克 | 快速5-15分鐘 | 考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時，其λmax由465nm變?yōu)?/span>595nm | 強堿性緩沖液，TritonX-100SDS | 的方法，干擾物質(zhì)少，顏色穩(wěn)定，顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 |
由上表可知，考馬斯亮藍法和Folin酚試劑法靈敏度zui高，比紫外吸收方法高10-20倍。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜，但是度較高，因此作物蛋白質(zhì)測定的標準方法，而蛋白質(zhì)測定儀的發(fā)明，更是推動了凱氏定氮法的發(fā)展。我們在選擇何種方法測定蛋白質(zhì)含量時，應(yīng)該根據(jù)實際情況，從下面幾個點考慮：1.實驗堆測定所要求的靈敏度和度。2.蛋白質(zhì)的性質(zhì)3.溶液中存在的干擾物4.測定時間。從以上四個方面綜合考慮，zui后選擇zui合適的測定方法。