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Western Blot內參抗體選擇原則

閱讀:1762      發布時間:2019-9-20
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Western Blot內參抗體選擇原則

 

內參抗體 種類很多,比如beta-actin、beta-tubunlin、GAPDH、α-tubunlin等,那么針對自己的實驗,我們該如何選擇呢?下面簡單介紹下選擇內參抗體應遵循的原則:

 

一.樣本種屬來源:

 

先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種。

1、哺乳動物的組織或者細胞樣本,通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atp ase等。

2、植物來源實驗樣本,則可以選擇plant actin、Rubisco等。

3、其他來源樣本研究較少,所以就應該參照文獻報導,選擇合適的蛋白 作為內參。


 

二.目的蛋白分子量 :

 

選擇內參抗體時,應該考慮目的蛋白分子 量的大小。通常應該保證目的蛋白與內參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD,此時不適宜選擇β-actin作為內參,可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內參。

 

三.目的蛋白表達 部位:

 

就一般的蛋白檢測來說,β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了,而針對于核蛋白的定量,特別是樣本蛋白就是核蛋白時,選擇恰當的核蛋白內參則更能體現內部參照的價值。常用的核內參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其它常見的核蛋白內參還有PCNA、K70、K80等,在一些文獻報道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而對于膜蛋白檢測,常用的內參抗體為Na,K ATPase。對于線粒體蛋白的檢測,常用VDAC1和COX IV作為內參抗體。
 

以上幾條原則只是針對通常情況,但是需要注意的問題是——內參的選擇需要考慮實際的試驗環境,比如某些細胞中,由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高,不適合做內參。比如在涉及細胞增殖相關試驗中,c-Jun由于自身表達變化就不適合做內參;而在凋亡實驗時,TBP、Lamin等也不適合作為內參。因此設計實驗方案的時候應該考慮這些因素并查詢相應文獻,在實驗過程中也應該注意如果內參表達出現異常,應考慮這方面因素。

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