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IPTG誘導原理

閱讀:3453      發布時間:2016-4-27
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異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,英文名稱IPTG。為安慰性誘導物,X-gal為生色底物,二者共同用于藍白斑篩選。IPTG可誘導載體lac操縱子DNA區段合成β-半乳糖苷酶氨基端片段,該片段可與宿主細胞編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實現基因內互補(α互補)。

IPTG誘導原理

E.coli的乳糖操縱子(元)含Z、Y及A三個結構基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉移酶,此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節?基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白,后者與O序列結合,使操縱子(元)受阻遏而處于關閉狀態。在啟動序列P上游還有一個分解(代謝)物基因激活蛋白(CAP)結合位點。由P序列、O序列和CAP結合位點共同構成lac操縱子的調控區,三個酶的編碼基因即由同一調控區調節,實現基因產物的協調表達。

其次

在沒有乳糖存在時,lac操縱子(元)處于阻遏狀態。此時,I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合,阻礙RNA聚合酶與P序列結合,抑制轉錄起動。當有乳糖存在時,lac操縱子(元)即可被誘導。在這個操縱子(元)體系中,真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞,經b-半乳糖苷酶催化,轉變為半乳糖。后者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白,使蛋白構象變化,導致阻遏蛋白與O序列解離、發生轉錄。異丙基硫半乳糖苷(IPTG)是一種作用*的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩定,因此被實驗室廣泛應用。

IPTG的優點

1.能誘導酶的合成,但又不被分解的分子,稱為安慰誘導物。由于乳糖雖可誘導酶的合成,但又隨之分解,產生很多復雜的動力學問題,因此人們常用安慰誘導物來進行各種實驗。

2.IPTG不被菌體代謝,為乳糖類似物,一旦進入細胞就會產生持續長久的誘導效果,所以IPTG的誘導效率高,往往只需要很少量(1mmol/L)即可達到理想誘導效果。由于IPTG不被代謝,在胞內專一誘導外源蛋白的表達。不受細胞代謝的影響,誘導效果持續穩定。乳糖有雙效作用,既能做為誘導劑異乳糖的前體物質,又可以做碳源,在誘導過程中,很不穩定,IPTG因其優異的穩定性決定了它適合做實驗研究用。

3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。

4.半乳糖苷鍵中用硫代替了氧,失去了水解活性,但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物與酶位點的親和力相同,IPTG雖不為β–半乳糖苷酶所識別,但它是lac基因簇十分有效的誘導物。

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