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試劑盒組成	K5000	K5001	儲存溫度
1NFolin-Ciocalteu Reagent Solution CTC Solution SoSDS BSAStandard （0.5mg/ml）	20ml 40ml 40ml 4X 1 ml	50ml 2X 50ml 2X 50ml 4X 1ml	4度室溫室溫室溫或-20度

注意：

1.溫度過低時，溶液中如果有鹽析，需要保溫使其溶解后使用。

2.BSA使用前，需要用水稀釋到濃度為0.05mg/ml。

原理：

蛋白質中的酪氨酸殘基與Folin-Ciocalteu酚試劑反應形成的有顏色的復合物，比較與已知蛋白質標準BSA形成的顏色從而確定未知蛋白質的含量。

注意：

1.該方法檢測的蛋白質濃度范圍1ug-50ug/ml。

2.Folin-Ciocalteu酚試劑的穩定期至少1年，CTC Solution穩定期為六個月。使用前根據需要的量取等體積的Solution CTC和Solution SoSDS混勻后，得到CTC Working Solution.混合后的必須在24小時內用完。。

3.由于Lowry法測定的是蛋白質中酪氨酸殘基，對于那些酪氨酸殘基數高于或低于BSA,其測定的蛋白質含量將偏低或偏高。如果遇到該情況，需要采用BCA或Bradford法測定。

4.閱讀測定方法后化學試劑對測定方法的影響。

測定方法（試管法）：

1.BSA標準品和樣品的準備：樣品用水或其他不干擾顯色反應的緩沖配置，使待測定的濃度位于標準曲線的線性部分。每個反應準備3個平行測定。標準曲線一般5-6個點即可，根據樣品的濃度確定各點的具體濃度。稀釋BSA時,可以用水，采用與樣品*或近似的溶液。

2.標準BSA使用前，需要用水稀釋到濃度為0.05mg/ml。可以在1.5ml Eppendorf管內做反應。在管壁上依次標上序列號，按下表所列在管內加BSA標準品和樣品。注意：每次反應都需要做一個和未知樣品溶液相同的空白對照。樣品如果濃度高于50ug/ml,需要用水或合適的緩沖稀釋，記錄稀釋的倍數。

	1	2	3	4	5	6	待測樣品稀釋1	待測樣品稀釋2
BSA （μl）（50ug/ml）	0	25	50	100	150	200	200	200
H₂O （μl）	200	175	150	100	50	0	0	0
CTC Working Solution, （μl）	200	200	200	200	200	200	200	200
	蓋上蓋子，室溫反應10分鐘
1NFolin-Ciocalteu Reagent （μl）	100	100	100	100	100	100	100	100
	蓋上蓋子，室溫反應30分鐘
OD₇₅₀


OD₇₅₀平均值
Con （μg/ml）	0	6.25	12.5	25	37.5	50

未知樣品濃度可以從標準曲線中查得, 實際濃度需要乘以樣品的稀釋倍數

3.用容量為0.5ml、光徑為1cm的比色杯測定750nm的光吸收。注意：染料如果吸附到比色杯壁上，杯子可以用甲醇清洗。測定時，測定濃度由低到高，測定未知樣品時需要將杯子清洗干凈，空白先測定，然后樣品。

4.標準曲線的繪制。注意：數據處理時需要去除明顯錯誤的值。未知樣品濃度可以從標準曲線中查得。如果是計算機繪制得曲線，可以從計算機給出的線性方程式計算出未知樣品的濃度。

測定方法（96微孔板法）

1． BSA標準品和樣品的準備：樣品用水或其他不干擾顯色反應的緩沖配置，使待測定的濃度位于標準曲線的線性部分。每個反應準備3個平行測定。標準曲線一般5-6個點即可，根據樣品的濃度確定各點的具體濃度。稀釋BSA時,可以用水，采用與樣品*或近似的溶液。

2．標準BSA使用前，需要用水稀釋到濃度為0.05mg/ml。按下表所列在孔內加BSA標準品和樣品。注意：每次反應都需要做一個和未知樣品溶液相同的空白對照。樣品如果濃度高于50ug/ml,需要用水或合適的緩沖稀釋，記錄稀釋的倍數。

	1	2	3	4	5	6	待測樣品稀釋1	待測樣品稀釋2
BSA （μl）（50ug/ml）	0	5	10	20	30	40	40	40
H₂O （μl）	40	35	30	20	10	0	0	0
CTC Working Solution, （μl）	200	200	200	200	200	200	200	200
	蓋上96孔板蓋，室溫反應10分鐘
1NFolin-Ciocalteu Reagent （μl）	20	20	20	20	20	20	20	20
	蓋上96孔板蓋，室溫反應30分鐘
OD₇₅₀


OD₇₅₀平均值
Con （μg/ml）	0	6.25	12.5	25	37.5	50

未知樣品濃度可以從標準曲線中查得, 實際濃度需要乘以樣品的稀釋倍數。

3．用酶標測試儀750nm測定光吸收。

4．標準曲線的繪制。注意：數據處理時需要去除明顯錯誤的值。未知樣品濃度可以從標準曲線中查得, 實際濃度需要乘以樣品的稀釋倍數。如果是計算機繪制得曲線，可以從計算機給出的線性方程式計算出未知樣品的濃度。注意：實際操作時不必每次都做標準曲線，可以做一兩個標準樣品，和標準曲線比較得出濃度系數。未知樣品的實際濃度=從標準曲線中得到的濃度*濃度系數。

注意：

一、如果樣品中含有影響測定的物質，按下法除去：

1．用水將樣品調到體積為200ml, 加入20ml 0.15%去氧膽酸鈉，混勻，室溫放置10分鐘。

2．加入20ml 72%的TCA,室溫放置5分鐘。

3． 3000X g離心15分鐘，小心去除上清，用200ml水溶解。此時的樣品可以用于測定。

二、常用化學試劑對Lowry法測定方法的影響

Glycin<100mM, HEPE<1mM, Imidazole<25mM, NaCl<1M, Tris<10mM, NaPi<100mM, CHAPS<0.05%, NP40<0.02%, SDS<1%, Trition X-100<0.03%, Tween<0.05%,EDTA<1mM, EGTA<1mM, Glucose<100mM, 2-Mercaptoethanol<1mM, Sodium Sitrate<100mM, Urea<3M, NaOH<100mM, PMSF<1mM, Sucrose<7%, Methanol<10%,DMSO<10%, Ethanol<10%, DMF<10%, Acetone<10%,Aprotinin<10mg.ml,.

NO DTT, No DTE and No Ammonium Sulfate （不能含DTE,DTT和硫酸胺）

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