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、試劑盒說明

熒光標記是研究細胞凋亡的zui基本方法。細胞凋亡的形態學變化及生化學變化都可以通過熒光標記的的方法而檢測出來，從而區別鑒別出正常細胞、凋亡細胞、壞死細胞以及不同凋亡時期或細胞周期。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種DNA結合性染料，其激發和發射波長分別為536nm和617nm，產生紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細胞膜，只能染死細胞。因此，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞不能著色，早期凋亡細胞呈微弱紅光，晚期凋亡細胞紅光加強，壞死細胞呈強紅色熒光。采用流式細胞儀檢測細胞周期時，凋亡細胞因內源性核酸酶被激活，使DNA廣泛降解、斷裂，DNA結構發生劇變，隨著凋亡的進程，DNA斷裂產生的小分子量DNA溢出胞外，細胞總DNA量降低，于正常G₀/G₁細胞群前出現一DNA低染細胞群，即G₁峰前出現亞二倍體峰（sub-G₁）或稱A0細胞群，即凋亡細胞群。用本試劑盒的PI直接對細胞DNA染色后，進行流式細胞儀分析，即可檢測到凋亡細胞DNA的變化。

二、試劑盒組份

組分	KGA214（100 assays）	儲存條件
Propidium Iodide, PI染液	500μL	4℃，避光
10×Buffer A	10 mL	4℃

注: 1×Buffer A配制：用前用雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍。

三、試劑盒儀器和試劑

熒光顯微鏡、低速離心機、微量移液器、1.5m L Microtube、載玻片、蓋玻片、

流式細胞儀、70%乙醇、RNase A

四、用注意事項

Propidium Iodide （PI）有毒，操作時要戴手套，需避光。

五、操作方法

1．熒光顯微鏡觀察

（1）收集細胞，1×Buffer A洗滌細胞一次（離心2000rpm，5min），加適量的

1×Buffer A重懸細胞，調整細胞濃度約為10⁶/mL；

（2）取95ul細胞懸液，加入5 μL PI染液，輕輕混勻；

（3）室溫避光放置5 min后，滴加于載玻片上，加蓋玻片；

（4）熒光顯微鏡，激發和發射波長分別為536nm和617nm，綠光*BG12濾光鏡觀察，拍照。

2．流式細胞儀分析

（1）用1×Buffer A洗滌細胞一次（離心2000rpm，5min），收集并調整細胞濃度為1×10⁶/mL；

（2）細胞加9倍體積的70%乙醇,于-20℃固定至少12小時；

（3）離心收集細胞后，用1×Buffer A洗細胞除去乙醇,細胞重懸于500 μLBuffer A中；

（4）加入RNase A（用戶自備），使其終濃度為0.25mg/ml, 37℃,反應30min；

（5）加入5μLPI室溫避光染色30分鐘；

（6）流式細胞儀或熒光光度計激發波長488nm檢測。

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