細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染試劑盒
（Apoptotic Cell Hoechst 33342/PI Detection Kit）
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Expire date：
一、試劑盒說明
熒光染料Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜，使其染上低藍色，而凋亡細胞的膜通透性增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多，熒光強度要比正常細胞中要高，此外，凋亡細胞的染色體DNA的結構發生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合，并且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內積累增加等都使凋亡細胞的藍色熒光增強。而PI染料是不能進入細胞膜完整的正常細胞和凋亡細胞中，即活細胞對PI染料拒染，而壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI染料染色。根據這些特性，用Hoechst 33342結合PI染料對凋亡細胞進行雙染色，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，這三群細胞表現分別為：正常細胞為低藍色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（Hoechst 33342++/PI+），壞死細胞為低藍色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。
二、試劑盒組份
| 組份 | KGA212（100 assays） | 儲存條件 |
| Heochst 33342 染液 | 1.0mL | 4℃，避光 |
| Propidium Iodide （PI） | 500μL | 4℃，避光 |
| 10×Buffer A | 10 mL | 4℃ |
注: Buffer A工作液配制用：雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍。
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
熒光顯微鏡或流式細胞儀、低速離心機、微量移液器、1.5m L Microtube、載玻片、蓋玻片
四、使用注意事項
1． 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上，還可見到細胞凋亡區向細胞壞死區遷移的軌跡，可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。
2． 用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20min之內為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發射光譜由藍光向紅光的遷移，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結果的判斷。
3．Propidium Iodide （PI）有毒，操作時要戴手套。
五、操作方法
1．懸浮生長的細胞離心收集，固定培養的細胞消化收集后，將105~106個細胞懸浮于1mL培養基中，再加入10μL Heochst 33342 染液，混勻，370C孵育5～15 min；
2．細胞于 40C ，500～1000r/min離心5min棄去上清液；
3．加入1.0mLBuffer A工作液（用雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍）懸浮細胞，加入5μL PI染液，室溫避光放置5～15min后混勻；
4．熒光顯微鏡觀察：
Heochst 33342用氪激光激發的紫外光，激發波長為352nm，發射波長為400～500nm，產生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發熒光，激發光波波長為488nm，發射光波波長大于630nm，產生紅色熒光。
5．流式細胞儀分析：
Heochst 33342用氪激光激發的紫外光，激發波長為352nm，發射波長為400～500nm，產生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發熒光，激發光波波長為488nm，發射光波波長大于630nm，產生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。結果判斷：在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上，結果為：正常細胞為低藍光/低紅光，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。
