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恒遠生物為您分析：脯氨酸含量測定實驗方法
閱讀：1210 發(fā)布時間：2014-2-20在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸（proline，Pro）的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。
脯氨酸測定原理：
用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出（或用回歸方程計算）脯氨酸的含量。
試劑：1. 酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，攪拌加熱（70℃）溶解，貯于冰箱中；
2. 3％磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml；
3. 冰醋酸；
4. 甲苯。
5. 6mmol/L的磷酸：320.6ml磷酸（分析純）定容到1L。
脯氨酸測定方法：
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
（1）在分析天平上稱取25mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每ml含脯氨酸100μg。
（2）系列脯氨酸濃度的配制：取6個50ml容量瓶，分別盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1，2，3，4，5及6 μg/ ml。
（3）6支試管，分別吸取2ml系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱30min。
（4）冷卻后各試管準(zhǔn)確加入4ml甲苯，振蕩30S，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。
（5）用移液器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，于520nm波長處進行比色。
（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸濃度（X）而變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算2ml測定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。
2. 樣品的測定
（1） 脯氨酸的提取：準(zhǔn)確稱取不同處理的待測植物葉片各0.5g，分別置大試管中，然后向各管分別加入5ml 3％的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取過程中要經(jīng)常搖動），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。
（2） 吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。
（3） 冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000rpm下離心5min。
（4） 用移液器輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對照，在分光光度計520nm波長處比色，求得吸光度值。