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被固定在基質上的分子稱為配體，配體和基質是共價結合的，構成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。親和層析時首先選擇與待分離的生物大分子有親和力物質作為配體，并將配體共價結合在適當的不溶性基質上。

將制備的親和吸附劑裝柱平衡，當樣品溶液通過親和層析柱的時候，待分離的生物分子就與配體發生特異性的結合，從而留在固定相上；而其它雜質不能與配體結合，仍在流動相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。通過適當的洗脫液將其從配體上洗脫下來，就得到了純化的待分離物質。