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普通PCR引物與qPCR引物的對比
閱讀：1358 發布時間：2023-6-30
普通PCR和熒光定量PCR的檢測方式具有較大的差別。熒光定量PCR實時監測與DNA結合的熒光染料激發的熒光，普通PCR通過檢測插入DNA中核酸染料的量來測定PCR最終產物量。熒光定量PCR可以通過擴增曲線進行精確定量，普通PCR則是通過電泳的方式進行定性分析。那么在普通PCR和熒光定量PCR的引物設計方面，有什么相同點和不同點呢？今天小編就給大家匯總一下。
相同處：
? 序列的查找是一致的。
? 序列選取應在基因的保守區段。
? 選取合適的擴增片段大小。
? 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對。
? 避免引物自身形成環狀發卡結構。
? Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%。
? 引物之間的Tm相差避免超過2℃。
? 引物的3’端避免出現3個或3個以上連續相同的堿基。
不同處：
熒光定量PCR 引物
? PCR產物長度：要求在300bp以內，一般80-150bp之間。
? 引物特異性：對引物要求高，盡量減少引物二聚體的產生，熔解曲線要求單一產物。
? 擴增效率：熒光定量 PCR的目的是進行定量或者相對定量，擴增效率應在90%—110%之間。
? 多對目的基因同時擴增，文獻上查來的引物條件會不同，需要設計盡可能條件一致的引物。
? 目的基因含量比較低時，需要設計靈敏度比較高的引物。
普通PCR 引物
? 普通PCR的擴增長度，根據實驗的要求不同，一般是從150bp到幾千bp不等。
? 相對于熒光定量PCR，普通PCR對二級結構要求較低。
? 對擴增效率要求不高。
? 可以選用梯度PCR儀，選擇不同退火溫度，對引物退火溫度要求不需要一致。