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TRIzol RNA 提取方法

閱讀:992      發布時間:2023-07-11
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原理

Trizol 是一種新型總 RNA 抽提試劑,采用變性劑即內含異硫氰酸胍酚和 β-巰基乙醇等變性物質,能迅速破碎細胞,抑制細胞釋放出的核酸酶。異硫氰酸胍屬于解偶劑,是一類強力的蛋白質變性劑,可溶解蛋白質,并使蛋白質二級結構消失,細胞結構降解,核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇主要破壞 RNase 蛋白質中的二硫鍵。細胞裂解后,細胞釋放出蛋白質、DNARNA 等物質,再根據它們在不同的 PH 值和不同極性溶劑的溶解度不同而使得分開。

材料與儀器

儀器:細胞樣品、TRIzol 試劑、氯仿、異丙醇、75% 乙醇、DEPCH2O
材料:離心管、離心機、EP 管、勻漿器、移液管、冰袋、漩渦振蕩器

步驟

1. 樣品處理:

1) 培養細胞:收獲細胞 1~5 × 107,移入 1.5 mL 離心管中,加入 1 mL Trizol,混勻,室溫靜置 5 min

2) 組織:取 50~100 mg 組織(新鮮或 -70 ℃ 及液氮中保存的組織均可)置 1.5 mL 離心管中,加入 1 mL Trizol 充分勻漿,室溫靜置 5 min

2. 加入 0.2 mL 氯仿,振蕩 15 s,靜置 2 min

3. 4 ℃ 離心,12000 g × 15 min,取上清。

4. 加入 0.5 mL 異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置 10 min

5. 4 ℃ 離心,12000 g × 10 min,棄上清。

6. 加入 1 mL 75% 乙醇,輕輕洗滌沉淀。4 ℃7500 g × 5 min,棄上清。

7. 晾干,加入適量的 DEPC H2O 溶解(65 ℃ 促溶 10~15 min

注意事項

1. 樣品量和 Trizol 的加入量一定要按步驟(1)的比例,不能隨意增加樣品量或減少 Trizol 量,否則會使內源性 RNase 的抑制不wan,導致 RNA 降解。

2. 實驗過程必須嚴格防止 RNsae 的污染。

常見問題

1. RNA 的定量計算:

RNA 定量方法與 DNA 定量相似,RNA 在 260 nm 波長處有最大的吸收峰。因此,可以用 260 nm 波長分光測定 RNA 濃度,OD 值為 相當于大約 40 μg/mL 的單鏈 RNA。如用 1 cm 光徑,用 ddH2O 稀釋 DNA 樣品 倍并以 ddH2O 為空白對照,根據此時讀出的 OD260 值即可計算出樣品稀釋前的濃度:RNAmg/mL) = 40 × OD260 讀數 × 稀釋倍數(n) / 1000

2. RNA 的純度:
RNA 純品的 OD260/OD280 的比值為 2.0,故根據 OD260/OD280 的比值可以估計 RNA 的純度。

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