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技術文章

ELISA實驗操作注意事項

閱讀:1107          發布時間:2021-2-19

一、關于夾心ELISA

夾心ELISA測定兩層抗體(即捕獲抗體和檢測抗體)間的抗原。靶抗原必須包含至少兩個能夠結合到抗體的抗原位點。

夾心ELISA去掉了分析前的樣品純化步驟,提高了靈敏度(比直接或間接法靈敏2–5倍)。

二、實驗步驟

1.用捕獲抗體包被

①以捕獲抗體濃度為1-10μg/mL的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6)包被PVC微量滴定板的孔。
②未純化抗體(例如腹水液或抗血清)可能需要增加樣品蛋白質的濃度(嘗試用10μg/mL)補償濃度更低的特異性抗體。
③用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜。
④棄去包被液,并洗滌微量滴定板兩次,每次在微孔中加入200μLPBS。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板,除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板,除去剩余的液滴。?

2.封閉和加樣
①每孔添加 200μL 封閉緩沖液(5% 脫脂奶粉/PBS)封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。
②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少1-2小時,或在4℃下孵育過夜。
③用200 μL PBS洗滌微量滴定板兩次。
④將100 μL 稀釋樣品添加到每個孔。通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每板都必須測定標準品(兩重測定或三重測定)和空白樣品。37°C條件下孵育90分鐘。確保標準品濃度涵蓋抗體結合的大部分動態檢測范圍。可能需要優化濃度范圍以獲得合適的標準曲線。通常樣品和標準品采取兩重測定或三重測定。
⑤移除樣品,用200μL PBS洗滌微量滴定板兩次。

3.用檢測抗體和二抗孵育

①將100μL稀釋的檢測抗體添加到每個孔。?確保檢測抗體識別與捕獲抗體靶蛋白的不同表位。這可防止對抗體結合的干擾。盡可能使用已測試的成對匹配抗體。
②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育2小時。
③用PBS洗滌微量滴定板四次。
④添加100μL偶聯二抗,使用前將其在封閉緩沖液中稀釋。
⑤用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育1-2小時。
⑥用PBS洗滌微量滴定板四次。

三、檢測

辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)是ELISA測定法中常用的兩種檢測酶。

考慮到某些生物材料具有高水平內源酶活性(例如肺泡細胞中的高水平ALP、紅細胞中的高水平過氧化物酶),這可能會導致非特異性信號。如有必要,用左旋咪唑(針對ALP)或用0.3% H2O2的甲醇溶液(針對過氧化物酶)進行另外的阻斷處理。

ALP底物

對硝基苯磷酸鹽(pNPP)是大多數應用常用的底物。室溫孵育15–30分鐘后在405 nm處測定硝基苯酚呈現的黃色,并加入等量0.75M NaOH 終止反應。

HRP顯色液

HRP的底物為過氧化氫。過氧化氫的裂解與氫供體的氧化偶聯,反應期間氫供體的氧化使顏色發生變化。

TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)

將TMB溶液添加到每個孔,孵育15-30分鐘,添加等體積的終止液(2M H2SO4),然后在450nm 處讀取光密度。

OPD(鄰苯二胺二yan酸鹽

在492 nm下測定終產物。底物對光敏感,應將其存放在暗處。

ABTS(2,2’-聯氮-雙-[3-乙基-苯并噻唑啉-6 磺酸] 二銨鹽)

終產物為綠色,可在416nm處測定光密度。

某些酶底物被認為是有害的(潛在致癌物),因此應始終小心處理并佩戴手套。


四、數據分析

由系列稀釋液得到的數據繪制標準曲線,濃度標在X軸(對數標度)上,而吸光度標在Y軸(線性標度)上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。

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