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過氧化物酶（pod）測試方法
閱讀：2554 發(fā)布時(shí)間：2016-10-26過氧化物酶（pod）測試原理：
過氧化物酶催化過氧化氫氧化酚類的反響，產(chǎn)品為醌類化合物，此化合物進(jìn)一步縮合或與別的分子
縮合，發(fā)生顏色較深的化合物。本試驗(yàn)以鄰甲氧基苯酚（即愈創(chuàng)木酚）為過氧化物酶的底物，在此
酶存鄙人，H2O2可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚紅棕色的物質(zhì)可用分光光度計(jì)在470nm處測定其消光值，即可求出該酶的活性。
試驗(yàn)準(zhǔn)備：
儀器：分光光度計(jì)、離心機(jī)、秒表、天平、研缽、磁力攪拌器
試劑：愈創(chuàng)木酚、30%H2O2、0.2mol/L磷酸緩沖液（7.8）、0.1mol/L磷酸緩沖溶液（PH6.0，見附錄）
反應(yīng)混合液[100mmol/L磷酸緩沖溶液（PH6.0）50ml，參加愈創(chuàng)木酚28μl，于磁力攪拌器上加熱攪
拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解、待溶液冷卻后，參加（待溶液冷卻后再參加，不然導(dǎo)致分解）30%H2O2
19μl，混合均勻，保留于冰箱中。
實(shí)踐的構(gòu)成和裝備：
試劑一：液體60ml×4瓶，4℃保留6個(gè)月
試劑二：粉劑×3瓶，4℃保留6個(gè)月
試劑二使用液的裝備：臨用每瓶粉劑參加10ml的雙蒸水溶解，4℃避光保留
試劑三：液體5ml1瓶，4℃保留6個(gè)月
試劑三使用液的制造：臨用前用雙蒸水15倍稀釋，使得1cm光徑，雙蒸水調(diào)零時(shí)A240保持在0.4擺布，現(xiàn)用現(xiàn)配。若A值太高，則加雙蒸水稀釋，若A值太低，則參加適量試劑三。（通常在25倍擺布稀釋）
試劑四：液體50ml×2瓶，4℃保留6個(gè)月。
說明書：
(1)檢查的成果沒有吸光度值或吸光度值很低
也許導(dǎo)致的原因有試劑盒已過有效期、運(yùn)用的試劑盒內(nèi)容物不是同一個(gè)批次的、沒參加 酶符號(hào)物、試劑盒的內(nèi)容物沒有充沛的回溫、孵育的溫度太低一級(jí)，相對(duì)應(yīng)的解 決辦法是替換 成在有效期以內(nèi)的試劑 盒、運(yùn)用 同～個(gè)批次的試劑盒的內(nèi)容物、依照試劑盒闡明書中的過程進(jìn)行操作、將試劑盒的內(nèi)容物充沛的回溫后再進(jìn)行操作、在試驗(yàn)操作的全部過程中請(qǐng)仔細(xì)觀察恒溫箱的溫度。
(2)規(guī)范曲線的線性 欠好，或 平行性欠好(雙孔對(duì)照孔的OD值 不一樣很大)，或呈現(xiàn)跳孔的景象
也許導(dǎo)致的原因有酶標(biāo)板孔間彼此污染、洗板后未能趕快進(jìn)行下一 步操作、增加樣品或其 它試劑時(shí)操作的辦法不對(duì)、孵育方位避光性欠安或蓋板膜沒有密封好使得水分蒸發(fā)、酶標(biāo)板孔問參加的試劑量不一樣，相 對(duì)應(yīng)的解決辦法是加樣時(shí)請(qǐng)當(dāng)心勿將液體濺人另一孔中，人工洗板時(shí)也請(qǐng)當(dāng)心，勿將洗滌液濺人另一微孔中、在洗板后及時(shí)進(jìn)行下一步操作、增加試劑時(shí)請(qǐng)懸空滴入，牢記勿將槍頭接觸到板 孔內(nèi)，汲取不一樣試劑瓶中的液體時(shí)就要替換一次槍頭 、 承認(rèn)孵育環(huán)境不透光，蓋板膜將酶標(biāo)板 密封好、運(yùn)用已校正過的微量加樣器，如將次參加液體時(shí)槍頭上留有一滴的液體滴下，那么將 今后槍頭上留有的液體也滴下，以確保參加液體體積的一致性 。
(3)吸光度值偏
高也許導(dǎo)致的原因有孵育的溫度過高、反應(yīng) 的時(shí)刻過長。相對(duì)應(yīng)的解決辦法是調(diào)整孵育環(huán)境的溫度，如無法調(diào)整 室內(nèi)的溫度，請(qǐng)將顯色時(shí)刻適當(dāng)?shù)目s短、操控反應(yīng)時(shí)刻。
?
(4)陰性樣本的吸光度值低
于陽性吸光度值也許導(dǎo)致的原因是呈現(xiàn)跳孔的景象或酶標(biāo)板孔中的試劑未充沛的混合。解 決的辦法是留意操作的辦法，留意洗滌時(shí)的辦法、加 完試劑后可將酶標(biāo)板在桌子上平行悄悄晃動(dòng)30s，混勻液體 。