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植物中脂氧合酶(LOX)試劑盒的測定原理是什么?

時間:2019/2/13閱讀:2129
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植物中脂氧合酶(LOX)試劑盒的測定原理是什么?

測定意義: LOX 廣泛存在于動植物組織中,催化不飽和脂肪酸氧化反應,導致膜脂過氧化。在生物體 的生長發育、成熟衰老及逆境脅迫過程中具有重要作用。

測定原理: LOX 催化亞油酸氧化,氧化產物在 280nm 處有特征吸收峰;測定 280nm 吸光度增加速率, 來計算 LOX 活性。

自備儀器和用品: 研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、可調 式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

試劑二:液體 20mL×1 瓶,4℃保存。 試劑三:粉劑×1 支,4℃保存。

粗酶液提取: 按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿。16000g,4℃離心 20min,取上清置冰上待測。

測定: 1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min 以上,調節波長到 280 nm,蒸餾水調零。

2. 在試劑三中加入 10mL 試劑二(振蕩混勻 1min),在 30℃水浴中預熱 10 min 以上。用不 完的試劑 4℃保存。

3. 對照管:依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 樣本和 180μL 試劑二,30℃反應 30min 后,記錄 A 對照。

4. 測定管:依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 樣本和 180μL 試劑三,30℃反應 30min 后,記錄 A 測定。 5. ΔA=A 測定-A 對照

LOX 活性計算:

(1)按照蛋白濃度計算 活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化 0.01 個單位為 1 個酶活單位。 LOX (U/mg prot) =ΔA×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T×100 = 33.33×ΔA÷Cpr

(2)按照樣本質量計算 活性單位定義:25℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化 0.01 個單位為 1 個酶活單位。

LOX (U/g 鮮重) =ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T×100 = 33.33×ΔA÷W Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL

需另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒; V 反總:反應體系總體積,200μL=0.2mL;V 樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02mL; W :樣品質量,g;V 樣總:上清液總體積,1mL;T:反應時間,30min。

植物中脂氧合酶(LOX)試劑盒的測定原理是什么?

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