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DNA修飾酶
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  • DNA修飾酶

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貨物所在地: 上海上海市
更新時間: 2025-03-03 15:02:21
期: 2025年3月3日--2025年9月3日
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產品簡介

DNA修飾酶通過對蛋白酶主鏈的剪接切割和側鏈的化學修飾對酶分子進行改造,改造的目的在于改變酶的一些性質,創造出天然酶不具備的某些優良性狀,擴大酶的應用已達到較高的經濟效益。

詳細介紹

操作步驟

1.培養細菌
將帶有質粒的大腸桿菌DH5α接種在LB 瓊脂培養基上,37℃培養24~48h。
2.從細菌中快速提取制備質粒DNA。

3.質粒DNA 的酶解
將自提質粒加入20μL 的 TE 緩沖液,使 DNA *溶解。取清潔、干燥、滅菌的離心管編號用微量加樣器按各種試劑分別加入每個離心管內。
4.DNA酶切加樣要求:

   1).選擇合適的酶切位點,并找到*緩沖液的酶切Buffer,可保證幾乎*的酶活性.

   2).每小時10-15U/ul的酶可以酶切1ug的質粒DNA,按照比例計算酶的使用量,酶量的加倍,可適當減少酶切時間。

   3).質粒DNA的量通常在反應體系中擴大10倍量,確保酶切*。1小時內,50μl反應體積中,降解1μg的底物DNA所需的酶為一個活力單位。因此酶:DNA的反應比例可以由此確定。較小的反應體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下,要注意酶的體積不要超過總體積的10%(一般酶都貯存于50%的甘油中)。 

   4).有的酶要求100μg/ml的BSA以實現*活性。在這種情況下,我們也相應提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響。 

   5).補無菌雙蒸水至相應體系,依實際情況做相應調整,加樣后,小心混勻,置于37℃水浴中,酶解2~3h,反應終止后,各酶切樣品于冰箱中貯存備用。
5.DNA 瓊脂糖凝膠電泳
  (1)瓊脂糖凝膠的制備:稱取0.6g 瓊脂糖,置于三角瓶中,加入50 mL TBE 緩沖液,經微波爐加熱全部融化后,取出搖勻,此為1.2%的瓊脂糖凝膠。
  (2)膠板的制備:將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液,小心倒入凝膠液,使膠液緩慢展開,直到在整個玻璃板表面形成均勻的膠層,室溫下靜置30 min,待凝固*后,輕輕拔出樣品槽模板,在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。
  (3)加樣:用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內。每次加完一個樣品,要用蒸餾水反復洗凈微量加樣器,以防止相互污染。
6. 電泳
加完樣品后的凝膠板,立即通電。樣品進膠前,應使電流控制在20mA,樣品進膠后電壓控制在60~80V,電流為40~50 mA。當指示前沿移動至距離膠板1~2cm 處,停止電泳。
7、結果與觀察
在波長為254nm 的紫外燈下,觀察DNA 存在處顯示出的熒光條帶。

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