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產品簡介
NovoRec® PCR一步定向克隆試劑盒（無縫克?。┦墙兜鞍踪|科技研發的產品。該產品可以不依賴于連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制，而直接用同源重組的方法，完成目的片段與載體相連接的基因克隆技術。該技術操作簡單，PCR產物一步定向克隆，目的片段與載體無縫連接，反應時間短至20分鐘，陽性率達到95%以上，讓您輕松完成實驗。
詳細介紹
產品介紹
NovoRec® PCR一步定向克隆試劑盒(無縫克隆)是近岸蛋白質科技研發的產品。該產品可以不依賴于連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制，而直接用同源重組的方法，完成目的片段與載體相連接的基因克隆技術。該技術操作簡單，PCR產物一步定向克隆，目的片段與載體無縫連接，反應時間短至20分鐘，陽性率達到95%以上，讓您輕松完成實驗。
反應原理
· 產品組成、穩定性及保存條件
1、產品組成
2、穩定性：此Kit在4℃保存3天不影響使用效率。
3、保存條件：收到后請立即離心；此kit可在-20℃長期保存，避免反復凍融。
· 使用方法
A.線性化載體的獲得
線性化載體可以通過兩種方法獲得，不管采取哪種方法，zui終線性化載體的濃度需>15ng/ul。(高濃度的載體有利于提高效率)。
1、酶切
選取合適的位點，單酶切或雙酶切皆可，并且5’端突出，3’端突出或平末端均適用本Kit。為了提高陽性率，我們建議您采取雙酶切載體。
2、PCR
選取合適的位點，設計正向和反向引物，引物長度一般在18-20bp左右，一般載體長度均大于3kb，建議用高保真的聚合酶擴增（推薦使用novoprotein pfu DNA 聚合酶，貨號：E002）。為了避免模板質粒DNA對后續試驗的影響，建議載體酶切后再用PCR擴增，自連背景更低，陽性率更高。
B.目的片段獲得
目的片段通常通過PCR獲得。引物設計要保證目的片段兩端有至少15bp序列與線性化載體的兩端*，特殊應用引物設計請參照技術手冊。 為保證PCR擴增的特異性及靈敏度，請盡可能選用pfu等高保真酶（推薦使用novoprotein pfu DNA 聚合酶，貨號：E002）。PCR每條引物長度至少在35-40bp，包括5’端與載體同源的15bp以及目的片段特異性序列20-25bp，（注意事項：如果是表達載體克隆構建，引物設計*后，請注意檢查讀碼框的正確）。
引物設計方法：
使用NovoRec PCR一步定向克隆試劑盒時，引物設計是很重要的，在設計引物時同樣要遵循引物設計的基本原則，只不過上下游引物要加上15-18bp的載體同源序列。
C.目的片段與載體的重組
1.將目的DNA和線性化載體以一定的摩爾比加到管子中進行重組反應,摩爾比可計算方法見下述NovoRec在線計算表。
2. 混勻后在37℃放置20分鐘;
3.立即進行轉化，剩余連接液可保存在4℃或-20℃待用。
注意：1.目的片段與載體的摩爾比在3：1-10：1之間，摩爾比低于3：1效率會降低
2.反應時間在20-40分鐘，時間太長不利于重組反應
D.轉化
我們建議所使用的感受態細胞效率要達到或>5X106 cfu/μg.
1. 冰上融化一管100 μl的DH5a感受態細胞，輕彈管壁使細胞重懸起來。加入10μl的反應液到感受 態細胞中，輕彈數下，置冰上孵育45分鐘。
2. 42℃水浴中熱激90秒后快速放入冰上5分鐘。
3. 加入500μl SOC液體培養基，37℃孵育45-60分鐘。
4. 5k離心3分鐘收集菌體，根據需要將一定量的菌體均勻的涂布在含抗生素平板上。
E.陽性克隆鑒定
一般的，我們建議采用菌落PCR進行陽性克隆鑒定(推薦使用Novoprotein 2x specific Mater Mix 貨號：E010)。
鑒定引物的選擇：為避免假陽性結果，我們建議一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。