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基因擴(kuò)增的基本要素及PCR基因擴(kuò)增儀的三步基本反應(yīng)
基因擴(kuò)增的基本要素及PCR基因擴(kuò)增儀的三步基本反應(yīng)
1、基因擴(kuò)增的基本要素
基因擴(kuò)增的基本要素與DNA復(fù)制的基本要素是一致的。
?、貲NA模板：待拷貝的DNA稱為模板，它可以是雙鏈DNA也可是單鏈DNA，后擴(kuò)增得到的產(chǎn)物是雙鏈狀態(tài)的。
?、谝铮菏荄NA復(fù)制的先鋒，就象結(jié)晶過(guò)程中的晶核，引導(dǎo)DNA的合成。在PCR擴(kuò)增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。
?、跠NA聚合酶(TaqDNA聚合酶)：是DNA復(fù)制的動(dòng)力，在dNTP等底物存在時(shí)在引物的引導(dǎo)下沿著模板DNA合成互補(bǔ)的DNA鏈。
④緩沖液：提供DNA合成反應(yīng)所需的pH，離子強(qiáng)度等環(huán)境。
?、?種單核苷酸：dNTP，提供DNA合成原料。
2、基因擴(kuò)增儀原理
基因擴(kuò)增儀是利用PCR技術(shù)對(duì)特定基因做體外的大量合成，用于以檢測(cè)DNA/RNA為目的的各種基因分析。
PCR反應(yīng)一般設(shè)置20~40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板。PCR的擴(kuò)增效率很高，如果循環(huán)次數(shù)是30次，那么新生DNA片段理論上達(dá)到230拷貝(約為109個(gè)分子)。
PCR基因擴(kuò)增儀的PCR由變性、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。
1.模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
2.模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
3.引物的延伸：DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性、退火、延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)增的目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。
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