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ELISA包括哪些實驗步驟和注意事項
ELISA實驗步驟
圖3 ELISA標準實驗流程
實驗前準備：
1. 樣本采集：
a) 血漿：采集血漿時可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑。采集后30分鐘內，1000xg離心15分鐘。立即檢測或分裝后于≤-20℃儲存。避免反復凍融。
b) 細胞培養上清液：通過離心去除顆粒，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
c) 細胞裂解液：在裂解緩沖液中裂解細胞并將其放在冰上靜置30分鐘。14,000xg離心5分鐘除去不溶物。將上清液轉移至新管中利用總蛋白分析法定量總蛋白濃度。立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。
d) 乏血小板血漿：在采集血漿時可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑。采集后30分鐘內，1000xg離心15分鐘。建議在2-8°C下，10,000xg 再次離心10分鐘，以便全去除血小板。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
e) 血清：使用不含抗凝劑的收集管，讓樣品在室溫下凝結30分鐘，然后1000xg離心15分鐘。立即取出血清并進行檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
f) 唾液：將唾液收集到管中，10,00xg離心5分鐘。收集水相，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
g) 尿液：無菌進行當天shou次尿液的采集(中段尿)，直接排入無菌容器中。離心去除不溶顆粒物質。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
h) 母乳：2-8°C，1000xg 離心15分鐘。重復進行水相部分的收集，總共3次。立即檢測。
i) 組織勻漿液：制備方法因組織類型而異。用1XPBS緩沖液沖洗以除去多余血液，使用20mL 1XPBS進行勻漿，并于≤-20°C下儲存過夜。將勻漿液凍融兩次以便破壞細胞膜，然后5000xg離心5分鐘。去除上清液后立即進行檢測，或者分裝后于≤-20°C儲存。避免反復凍融。
j) 組織裂解液：用PBS沖洗組織，將組織切成1-2mm的薄片，用組織勻漿器在PBS中進行勻漿。加入等體積的含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液，在室溫下裂解組織30分鐘，裂解過程中輕搖裂解液。離心去除沉淀。利用總蛋白質分析法定量總蛋白的濃度。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。
2. 預實驗
ELISA實驗中進行預實驗是非常有必要的，一方面為了檢測試劑盒是否好用，標曲擬合線性是否良好，最高OD值是否能達到2.0左右，是否存在假陽性假陰性；另外一方面為了檢測樣本最佳稀釋比例，樣本濃度過高要進行稀釋；樣本濃度過低要選擇超敏試劑盒。
3. ELISA實驗對照
a) 空白對照：提供背景信號參考，并確保讀取值表示樣品中的分析物濃度。
b) 陽性對照：已知含有目標蛋白的內源性可溶樣品，或已知含有檢測抗體免疫原的純化蛋白或多肽來作為陽性對照。當樣品的檢測結果為陰性時，陽性對照的陽性結果可表明實驗過程無誤且有效，所以實驗的陰性結果是真實的。
c) 陰性對照：已知不表達目標蛋白的樣品。其有助于檢測非特異性結合和假陽性結果。
d) 標準品：含有已知濃度的目標蛋白的樣品，可從中獲得標準曲線。
e) 樣本基質中的標準品（加標對照品）：加標對照可用來給出有關某種特殊樣品基質中分析物發現程度的信息，從而表明檢測性能。比如，在 ELISA 中檢測血清樣品時，按照慣例標準品用正常稀釋緩沖液來稀釋。但可以同時用檢測的種屬血清來稀釋標準品。
4.實驗步驟（以Human IL-6 ELISA Kit – Quantikine，Catalog # D6050）
1. 使用前將所有試劑和樣品置于室溫。建議所有標準品、對照品和樣品一式兩份；
2.用不完的微孔板條可以移除，將它們放回含有干燥劑包裝的箔袋中，并重新密封；
3. 每孔加入100 μL檢測稀釋劑RD1W；
4. 每孔加入100 μL標準品、對照品或樣品，蓋上蓋子。室溫孵育2小時。同時做好板布局的記錄；
5. 棄去液體，使用400 μL洗滌緩沖液洗滌，重復三次，共洗滌四次。有條件的話可以使用自動洗板機，最后一次洗滌的時候，去除掉所有洗滌緩沖液后，把孔板倒置，用干凈的吸水紙吸干；
6. 每孔加人IL-6檢測抗體200 μL。蓋上蓋子，室溫孵育2小時；
7. 重復步驟5中的洗滌；
8. 每孔加底物溶液200 μL，室溫下孵育20分鐘，避光；
9. 每孔加入50 μL反應停止液。并且能夠觀察到孔里的顏色從藍色變成黃色。如果孔內顏色呈綠色或顏色變化不均勻，輕拍板以確保充分混合；
10. 在30分鐘內測定每個孔的吸光度，設置酶標儀波長為450nm。如果有波長校正，請設置為540nm或570nm。如果波長校正不可用，可以用450nm讀數減去540nm或570nm讀數。
ELISA操作小技巧
圖4 ELISA操作小技巧（圖源于R&D）
ELISA常見問題
| 常見問題 | 原因 | 解決方法 |
| 無信號或信號低，但標準曲線正常 | 樣本中無目標分子 或目標分子濃度低于試劑盒檢測范圍 | 更換可以檢測濃度更低的試劑盒 或對樣本進行濃縮 |
| 樣本中的基質效應干擾了目標蛋白與抗體結合 | 用適當的稀釋液對樣本進行濃縮梯度處理，檢測稀釋的線性度是否良好，設置加標對照品 | |
| 標準品和樣品都無信號或信號低 | 標準品問題 標準品毀壞（樣品孔有信號） 標準品重溶方法是否正確 | 重新使用一瓶新的標準品 待標準品恢復室溫后，按照說明書加入提及的稀釋液，充分溶解15分鐘 |
| 顯色試劑是否有效 顯色時間不充足 | 進行color test 增加顯色時間 | |
| 實驗條件與操作問題 | 孵育溫度，時間，是否需要振蕩器，酶標儀是否設置正確等 | |
| 信號強 | 樣本中檢測分子的濃度高，超出試劑盒檢測范圍 | 對樣本進行適當的稀釋 |
| 洗滌不充分，殘留有未結合的過氧化物酶 | 按照說明書進行充分洗滌（洗板機，增加洗滌次數） | |
| 板孔有干掉的情況 | 洗滌和加樣的過程中速度要快一些 | |
| 顯色液、終止液未及時使用 | 顯色液、終止液盡量現配現用 | |
| CV值高或者重復性差 | 洗板不規范導致washing buffer殘留，使后加的反應試劑濃度不穩定 | 洗滌步驟嚴格按照說明書操作 |
| 顯色試劑不穩定 各板孔的抗體不穩定，不均一 | 盡量選擇質量有保障的試劑盒 | |
| 實驗溫度問題 | 保持溫度適當且無明顯變化 | |
| 實驗操作問題 | 嚴格要求操作細節 |
文中部分相關產品
| 產品名稱 | 貨號 | 特點 |
| Picus 電動移液器 | 735461 | 12通道， 10-300 µl |
| Tacta手動移液器 | LH-729230 | 12通道， 5–100 µl |
| 數顯旋渦振蕩器 | VM-D | 超大可調量程300-4200rpm，適用于各種強度混合 |
| PE VICTOR NivoTM 酶標儀 | NIVOF | 32位濾光片轉輪，可在不同波長條件下執行檢測，滿足所有實驗 |
| 酶標板震蕩器 | 3208025 | 可震蕩2塊或4塊酶標板 |
| arium® mini plus純水超純水一體機 | H2O-MA-T | 同時產出Type3級反滲透純水和Type1級超純水 |
參考資料：Bio-techne ELISA技術指南
上海優寧維生物科技股份有限公司
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