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一、類器官收集及洗滌

1、類器官收集

移液器吸去培養基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養緩沖液(abs9730)，輕柔吹打基質膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組），加類器官傳代緩沖液定容至10mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置10min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱保溫效果強，冷凍3min），300g 4℃，離心5min棄上清。

2、類器官清洗

添加1mL類器官傳代培養緩沖液重懸，300g 4℃，離心5min棄上清。

二、類器官免疫熒光染色

1）4%多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，每次2min；

2）0.5%Triton透膜20min，PBS洗3次，每次2min；（如果需檢測的目的蛋白屬于胞內蛋白或者抗原抗體結合位點位于胞內的跨膜蛋白，抗體孵育前需進行透膜處理）

3）1%BSA室溫封閉60min，PBS洗3次，每次2min；
4）5%BSA稀釋的一抗，4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次2min；
5）5%BSA稀釋的TRITC標記的二抗，室溫避光孵育1h，PBS洗3次，每次2min；
6）5ug/mLDAPI避光孵育15min，PBS洗3次，每次2min；
7）將類器官輕柔鋪在載玻片上，吸水紙輕輕吸取多余殘留液體；
8）指甲油封片輕柔固定，于激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

注：PBS清洗時，可用槍頭輕輕吹起避免氣泡，待類器官沉淀到底部開始下一步操作。

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