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一分鐘帶你了解免疫熒光技術步驟及原理

閱讀:1809      發布時間:2023-6-25
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  IF實驗
  免疫熒光技術
  原理:免疫熒光技術是根據抗原抗體反應的原理,先將已知的抗原或抗體標記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原(或抗體)。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標本,熒光素受外來激發光的照射而發生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見熒光所在的組織細胞,從而確定抗原或抗體的性質、定位,以及利用定量技術測定含量。
  步驟:
  細胞準備:對單層生長細胞,在傳代培養時,將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中,待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細胞,取對數生長細胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
  固定:根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.
  通透:使用交聯劑(如多聚甲醛)固定后的細胞,一般需要在加入抗體孵育前,對細胞進行通透處理,以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
  封閉:使用封閉液對細胞進行封閉,時間一般為30min.
  一抗結合:室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次,每次沖洗5min.
  二抗結合:間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次。
  封片及檢測:滴加封片劑一滴,封片,熒光顯微鏡檢查。

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