煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，簡稱NADP）與NAD的不同之處只在于其分子有一個(gè)額外的磷酸基，NADPH是它的還原形式。NADP+參與生物合成反應(yīng)，如脂質(zhì)和核酸的合成。在動(dòng)物細(xì)胞中，戊糖磷酸途徑的氧化階段是NADPH的極重要來源。NADP/NADPH的定量測(cè)定在細(xì)胞或組織的能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)的研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

艾美捷 NADP/NADPH 檢測(cè)試劑盒（熒光法）：

目錄代碼：BA0107

包裝尺寸：100assays

僅供研究使用

NADP/NADPH 檢測(cè)試劑盒應(yīng)用程序

直接測(cè)定：細(xì)胞或組織提取物中NADP’/NADPH的濃度和比率。

NADP/NADPH 檢測(cè)試劑盒主要功能：

1、靈敏準(zhǔn)確。96孔板法檢測(cè)限為0.01μM，線性高達(dá)1μM NADP+/NADPH。實(shí)用的該程序包括添加一種工作試劑，并在時(shí)間0和30讀取熒光

Zui低室溫測(cè)定。

2、高吞吐量。可作為每天數(shù)千個(gè)樣品的高通量96孔板法容易地自動(dòng)化。

儲(chǔ)存條件：這套裝備是用冰塊裝運(yùn)的。將所有試劑儲(chǔ)存在20°C的溫度下。保質(zhì)期：收到后6個(gè)月。

注意事項(xiàng)：試劑僅供研究使用。使用試劑時(shí)，應(yīng)采取實(shí)驗(yàn)室試劑的常規(guī)預(yù)防措施。有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱材料安全數(shù)據(jù)表。

一般注意事項(xiàng)：

1.在這些濃度下，NADP’和NADPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線是相同的。由于溶液中的NADPH不穩(wěn)定，我們只提供NADP作為標(biāo)準(zhǔn)。

2.該測(cè)定基于酶催化的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。工作試劑的添加應(yīng)迅速，混合應(yīng)簡短但徹-底。建議使用多通道移液器。

3.以下物質(zhì)會(huì)干擾樣品制備，應(yīng)避免使用。EDTA（>0.5 mM）、抗壞血酸、SDS（>0.2%）、疊-氮-化-鈉、NP-40（>1%）和Tween-20（+1%）。

程序

1.樣品制備。對(duì)于每個(gè)樣品重量約為20 mg的組織，用冷PBS清洗。對(duì)于細(xì)胞樣品，用冷PBS洗滌細(xì)胞，每個(gè)樣品用約105個(gè)細(xì)胞沉淀。將樣品（組織或細(xì)胞）在1.5 mL Eppendorftube中用100μL NADP提取緩沖液（用于NADP測(cè)定）或100μL NADPH提取緩沖液均勻化（用于NADPH測(cè)定）。將提取物在60°C下加熱5分鐘，然后加入20μL測(cè)定緩沖液和100μL反向提取緩沖液以中和提取物。短暫渦旋并以14000rpm旋轉(zhuǎn)樣品5分鐘。使用上清液進(jìn)行NADP’/NADPH測(cè)定。NADP+和NADPH濃度的測(cè)定需要從兩個(gè)單獨(dú)的樣品中提取。

2.校準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)備500mL 1µM NADP+預(yù)混物，混合5mL 1mM標(biāo)準(zhǔn)和4995mL蒸餾水。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品如下：

3.樣品。在單獨(dú)的孔中，每孔添加50μL樣品。

4.試劑制備。對(duì)于每個(gè)反應(yīng)井，通過混合40μL測(cè)定緩沖液、1μL酶A、1μL-酶B、10μL葡萄糖和5μL探針來制備工作試劑。建議重新配制。

5.反應(yīng)。每孔快速加入50μL工作試劑。輕敲盤子攪拌。

6.在室溫下孵育30分鐘后，在λev/em=530/585 nm下讀取時(shí)間“零"（Fo）和F3o的熒光。在培養(yǎng)過程中，請(qǐng)保護(hù)培養(yǎng)板免受光照。

文獻(xiàn)參考：

1.Zhao, Z, Hu, X and Ross CW (1987). Comparison of Tissue Preparation Methods for Assay of Nicotinamide Coenzymes.Plant Physiol.84:987-988.

2.Matsumura, H. and Miyachi S (1980). Cycling assay for nicotinamide adenine dinucleotides. Methods Enzymol. 69:

465-470.

3. Vilcheze, C et al.(2005). Altered NADH/NAD+ Ratio Mediates Coresistance to lsoniazid and Ethionamide inMycobacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.49(2): 708-720.