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雞胚成纖維細胞制備實驗

閱讀:561          發布時間:2019-1-10
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實驗方法原理    
用雞胚制備培養雞胚成纖維細胞。
實驗材料    9 日齡雞胚
試劑、試劑盒    70% 乙醇胰酶/EDTA無添加 MEM 培養基* MEM-10 培養基
儀器、耗材    無菌解剖剪無菌鑷子100 cm2 無菌培養皿10 ml 注射器無菌胰酶消化瓶(帶磁力攪拌棒)CO2 培養箱500 ml 燒杯紗布 Sorvall 離心機250 ml 離心管150 cm2 組織培養瓶
實驗步驟    
1. 將 10 只 9 日齡雞胚有空氣部分朝上放置,噴上 70% 乙醇。

2. 用無菌的解剖剪將雞蛋的頂部打開,剪掉膜上蛋殼,使膜保持完整。用無菌鑷子將膜取掉。其他雞蛋亦重復相同操作。

3. 取出雞胚,放入無菌的 100 cm2 培養皿。

4. 剪掉每個雞胚的頭和足,將剩余的身體放入無菌的 100 cm2 平皿中,加入 10 ml 無添加劑的 MEM 培養基。通過 10 ml 注射器(5 個雞胚/注射器)擠壓,將雞胚切碎并打人無菌的胰酶消化瓶中。

5. 加入 100 ml 37℃ 的胰酶/EDTA,并在加濕的 5% CO2 培養箱中 37℃ 持續攪拌溫育 5 min。

6. 將液體從無菌胰酶消化瓶中倒人杯口帶兩層紗布的 500 ml 燒杯,將過濾后的液體轉移至 250 ml 離心瓶中。

7. 向含有剩余組織的無菌胰酶消化瓶中加入 100 ml 新鮮的胰酶/EDTA,37℃ 溫育。

8. 將消化液倒入另一個杯口帶兩層紗布的 500 ml 燒杯,并將過濾后的液體加入先前的 250 ml 離心瓶中。

9. 在 Sorvall RC-3B 離心機中,4℃,1200 g 離心 10 min。

10. 丟棄上清,加入 10 ml MEM-10 *培養基,反復抽吸 10~15 次重懸沉淀,并將體積調整至 100 ml。

11. 將懸液轉移至 250 ml 離心瓶中,4℃,1200 g 離心 10 min。

12. 用 5 ml MEM-10 *培養基重懸沉淀,并將體積調整至 30 ml。

13. 將細胞懸液按每瓶 1 ml 加入到 30 個含有 30 ml MEM-10 *培養基的 150 cm2 組織培養瓶中。

14. 37℃ 培養幾天直至細胞長滿,然后將培養瓶轉移至加濕的 5% CO2 培養箱中 31℃ 保存。

CEF 細胞培養液能夠在 31℃ 保存 2~3 個星期。原代的 CEF 細胞也能直接用于病毒生長,或將胰酶處理后的 CEF 細胞凍存在液氮中留以后使用。

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