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產品簡介
一管式點突變試劑盒基因的定點突變是重要的分子生物學技術，廣泛用于載體構建、基因改造、蛋白質功能研究等領域
詳細介紹
一管式點突變試劑盒基因的定點突變是重要的分子生物學技術，廣泛用于載體構建、基因改造、蛋白質功能研究等領域。但傳統的方法需要使用單鏈 DNA 模板，而得到單鏈 DNA 模板又需要
先將基因克隆到類似 M13 這種載體中，操作過程冗長。為了克服這些缺點，本公司將突
變位點設計到一對互補的引物中，用高保真擴增質粒模板，然后用 Dpn I 去除原始的甲
基化模板，新合成的 DNA 通過互補形成帶切口的雙鏈質粒，直接用于轉化感受態細菌。
本方法過程示意圖如下：
一管式點突變試劑盒具有下列特點：
1. 直接使用質粒 DNA 作為模板，免去了制備單鏈 DNA 的步驟。
2. 基于高保真 PCR，對模板 DNA 序列沒特殊要求，可以用于突變任何序列。
同時對模板的需求量很少。
3. 一管式，全部在一個優化的緩沖體系中完成，非常簡單。
4. 使用 Dpn I 去除未突變模板，突變效率高達 90%。
5. 可用于制備點突變，缺失突變和插入突變。
6. 本產品 A 型適用于 8 kb 以下，B 型適用于 8-15 kb。
規格及成分 成 份 編 號 A 型 10 次包裝 B 型 10 次包裝
高保真酶 A 型 10 uL 無
高保真酶 B 型 無 10 uL
5×高保真酶 Buffer A 型 100 uL 無
5×高保真酶 Buffer B 型 無 100 uL
dNTP（2.5 mM each） 50 uL 50 uL
Dpn I 酶 10 uL 10 uL
超純水 100935 1 mL 1 mL
使用手冊 1 份
運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑 質粒 DNA、突變引物、細菌轉化試劑
使用方法 一、 引物設計及注意事項
用于特定基因突變的引物必須用戶單獨設計，請參考如下一些基本原則進行設計。
1. 共需設計兩條*互補的一對引物，它們覆蓋要擴增的突變區位點，突變位點
zui放在引物的中心。可以先集中設計一條，然后就可得互補的另一條引物。
2. 引物的長度通常為 25-45 個堿基。引物中突變位點任何一側都必需滿足 Tm 大
于 45 的條件，Tm 計算方式為 Tm=4×(GC 堿基數)＋2×(AT 堿基數)。例如
引物 agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就達到此標準，它的突變位點
AAG 所放位置使左側 Tm＝46；右側 Tm＝48，均大于 45。
3. 盡量把引物的 GC 含量控制在 40％-60％，結尾的 1-3 個堿基zui是 G 或 C。
4. 盡量使引物不要產生非常穩定的二級結構和引物二聚體。
5. zui使用經過 PAGE 純化的引物或更高純度的引物。
二、待突變模板質粒的選擇
1. 必需使用從 dam＋的大腸桿菌(這類菌中質粒可以被甲基化)中抽提得到的質粒
用于基因定點突變，否則 Dpn I 不能把沒有酶切的質粒 DNA 切除，產生大量
的假陽性。常用的大部分大腸桿菌都是 dam＋的，包括 DH5α、JM109 等。
不能使用 JM110 和 SCS110 以及其它 dcm-菌種。
2. 待突變質粒和目的基因的 GC 含量應該在 40-55％，沒有任何 GC 含量超過
70%、長度在 50bp 以上的區域。如果質粒 GC 含量過高，請先把目的基因克
隆到其它合適的載體上，再進行基因定點突變反應。如果目的基因 GC 含量過
高，而突變位點不在高 GC 含量區域，可以先把該基因的不含高 GC 含量的一
個區域克隆出來，進行定點突變，然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如
果突變位點在高 GC 區，則可以使用高 GC PCR 反應試劑。
三、 基因定點突變反應
1. 在一個塑料離心管中加入下列成分：
待突變模板質粒 0.1-0.5 ug
5×高保真酶 Buffer 10 uL
引物一 (10-20 uM) 1 uL
引物二 (10-20 uM) 1 uL
dNTP Mix (2.5 mM each) 4 uL
補水到 49 uL
2. 加入 1 uL 高保真 DNA 聚合酶，混勻，如果 PCR 儀沒有熱蓋則需要加少量石
蠟油。放入 PCR 儀器中按下面參數進行 PCR：
步驟 溫度 時間 循環數
變性 95℃ 1 分鐘 1 次
PCR
（注：只 18 次循環）
95℃ 40 秒
60℃ 1 分鐘 18 次
68℃ 1 分鐘/Kb
延伸 72℃ 10 分鐘 1 次
保存 4℃ 長時間保持
四、Dpn I 消化：
PCR 反應后，直接在 PCR 反應體系中加入 1uL Dpn I 內切酶 （該酶在甘油保
存液中會下沉到管底，故用前需要充分混勻）。DpnI 可以酶切雙鏈都被甲基化的模
板質粒，也能降解一條鏈被甲基化的雙鏈質粒?；靹蚝?37℃孵育 2 小時后樣品可以
直接用于轉化，或者-20℃保存備用。
五. 轉化、挑克隆鑒定：
每 100 微升感受態細菌（轉化效率必須在 107 /ug 以上）中可以加入 5-10
微升經過Dpn I消化后的突變產物，按照所使用的感受態細菌的操作方法進行操作。
如果 PCR 使用了石蠟油，在轉化時千萬別把它帶入轉化反應，否則會嚴重影響轉
化效率。在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉化后的細菌全部涂布到含有適
當抗生素的平板上培養過夜。通常會得到 50 個以下的克隆，可按常規方法制備質
粒并測序。
六、常見問題：
1. 轉化后沒有克隆或克隆數極少：(1) 感受態細菌效率不夠高，請檢測一下感受態
細胞的效率，確保轉化效率在 107 /ug。(2) 把 Dpn I 消化后的產物用常規的乙醇
沉淀濃縮，這樣就可以把所有的產物全部用于轉化。(3) 優化基因定點突變中的PCR
參數。可以把zui初的 95℃變性時間延長為 2 分鐘，循環中 95℃變性的時間延長至
1 分鐘，把循環中的 68℃的延伸時間改為 1.5 分鐘/kb 至 2 分鐘/kb，退火可以
改為 60-55℃或 65-55℃等的 touch down，退火時間也可以適當延長。(4) 引物
設計有問題。通過突變反應中的 PCR 沒有很好地擴增出預期的突變質粒。
2. 有克隆，但沒有或很難檢測到預期的突變克隆：(1) 使用的待突變的模板質粒量
過多，導致 Dpn I 消化時不*，可減少質粒用量。
3. 有突變克隆，但突變位點不是預期的位點：(1) 引物設計不佳，退火溫度過低，
導致引物退火到錯誤的地方。(2) 引物質量較差，沒有經過 PAGE 純化。這樣引物
中通常會含有比設計的引物要短的特異性較差的引物，容易導致非預期的突變。