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產品簡介
乙型肝炎病毒（HBV）cccDNA PCR檢測試劑盒乙肝病毒共價閉合環狀 DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）是乙肝病毒前基因組 RNA 復制的原始模板，雖含量較少
詳細介紹
乙型肝炎病毒（HBV）cccDNA PCR檢測試劑盒乙肝病毒共價閉合環狀 DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）是乙肝病毒前基因組 RNA 復制的原始模板，雖含量較少，每個肝細胞內只有約5～50 個拷貝，但對乙肝病毒的復制以及感染狀態的建立具有十分重要的意義，
只有清除了 cccDNA，才能*消除乙肝患者病毒攜帶狀態。因此 cccDNA 的
檢測具有重要的臨床意義，本產品即是乙肝病毒 cccDNA 快速檢測試劑盒。它
乙型肝炎病毒（HBV）cccDNA PCR檢測試劑盒具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒 DNA 模板。
2. 引物經過優化，特異性高。
3. 熒光定量 PCR 檢測，qPCR Mix 所含 SYBR Green I 只與雙鏈 DNA 結合，
反應特異性強。
4. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
規格及成分 成分 編號 50 次塑料袋包裝
2×qPCR Mix 90408 1 mL
cccDNA 專一性引物對 yw1000-1-2 100 μL
陽性對照 1000-1-2 50 μL
RNase-free 水 80403 1 mL
使用手冊 1 份
運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限一年。
自備試劑 樣品等
使用方法 一、樣品 DNA 的制備
用自選方法提取 HBV cccDNA。注意：病毒 DNA 純化方法是決定檢測靈
敏度的關鍵因素。如果不能很好純化 HBV DNA，后面的 PCR 再靈敏也不
能提高整體檢測靈敏度。
二、制備 cccDNA 標準曲線（以 10-10E6 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準
品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染
樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，
不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的
DNA段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2 和 1 號。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（zui用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用 TE 緩沖液或超純水 10 倍梯度稀釋到
10E7 拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標準品一次性稀釋至 10E7
拷貝/μL，建議每次稀釋 10 倍，梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL）。
4. 在 6 號管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的 CPV 陽性對照(上步稀釋所得)，
充分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽性對照。
5. 換槍頭，從 6 號管中取 5 μL 溶液到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5
拷貝/μL 的陽性對照。
6. 換槍頭，從 5 號管中取 5 μL 溶液到 4 號管中，重復上面的操作直到得到 6
個稀釋度的陽性對照。
7. NC 管中不加任何陽性對照。
8. 從 1-6 號管中分別取 5 μL 和待測樣品一起進行定量 PCR（見下步），每個
樣品做 3 次重復。PCR 后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光 PCR Ct 值，
并以之為縱軸，以濃度的對數值為橫軸，繪制標準曲線。
三、PCR 檢測（20 μL 體系）
1. 在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復，下表只列出一次）：
成分 樣品 陰性對照
2×qPCR Mix 10 μL 10 μL
待測樣品 DNA 模板 1-5 μL 無
陽性對照 無 無
自備 10×ROX (見注) 2 μL 2 μL
專一性引物對 2 μL 2 μL
補水到 20 μL
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR
儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、
RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。
2. 建議 PCR 反應參數（具體 PCR 參數可以根據儀器不同而自行優化）
過程 溫度 時間
活化 94℃ 1 min
PCR 反應
（40 個循環）
94℃ 10 s
60℃ 30 s
3. 數據采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合
DNA 時，zui大吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的zui大吸收光譜在 500 nm，
zui大發射光譜在 530 nm。
四、數據處理
以 CPV 陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再
以待測樣品濃度的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸，通過待測樣品的 Ct 值計
算出樣品 DNA 的濃度。
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