接下來為大家隆重介紹 BIA Separations 提供的，基于對流相互作用介質（CIM）層析整體柱的兩步質粒 DNA（pDNA）純化平臺！
該方法除了具有以上全部優點，并且可以純化時間，提高生產效率，使其成為 GMP 環境下的大規模 pDNA 純化的選擇。
該方法專為純化大分子和納米顆粒的整體柱而設計，可實現快速操作，高流量，同時提供動態結合能力和分辨率。

首先要為整個過程中的核心——兩步層析步驟，準備細菌培養液

1. 大腸桿菌收獲、裂解－堿裂解：

這是快速高效純化質粒 DNA 亞型的基礎。

操作建議：

先收集菌體；
然后采用堿性裂解法制備原料；

再將細菌細胞（通常是細胞生物質或細胞沉淀）懸浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；

通過加入等體積的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 進行裂解。

2. 裂解液濃縮：

氯化鈣沉淀后澄清，除去了大量的主要樣品雜質

裂解后，懸浮液變粘稠，通過加入與懸浮緩沖液等體積的，4-8℃ 冷卻的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀細胞碎片和 SDS 復合物。

在溫和混合下，緩慢加入 CaCl2 并孵育 15 分鐘。

TIPS:

1. 氯化鈣用作沉淀劑，以去除 RNA、基因組 DNA 和其他雜質;

2. 較高濃度的雜質需要 CaCl2 濃度高達 1M;

3. 考慮測試多種濃度并評估產品中雜質的有效去除和未受影響的 pDNA 產量;

4. 加入速度應該很慢，以防止局部溫度上升;

5. 孵育后，進行一系列澄清步驟，從離心或粗過濾開始，例如 80μm 深度過濾，并以 1-5μm 過濾結束。

（低溫有利于沉淀，混合過程應該溫和操作，以防止 DNA 降解。）

前面 blabla 說了那么多，然而純化才是本工藝的精華所在。

BIA Separations 的二步純化工藝的穩健性、連貫性、時效性，均堪稱教科書式的經典。

步純化的柱子，通過弱陰離子交換，濃縮 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA；

步利用疏水相互作用色譜（HIC）的拋光步驟，進一步從超螺旋（SC）級 pDNA 中除去開環（OC）和線性 pDNA 亞型。

兩步純化的作用功能明確、互相合作，大大節省操作步驟和時間。

AEX 色譜柱（CIMmultus™DEAE）濃縮 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA。

在弱陰離子交換柱上捕獲質粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白質，樣品結合需要低電導率，通過稀釋實現。

隨著增加 NaCl 的梯度洗脫，首先洗脫 RNA，然后洗脫質粒 DNA。

層析條件

*1 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。

層析方法

1. 用去離子水稀釋細菌裂解物至電導率為 35-40mS / cm。稀釋取決于樣品制備過程中添加的 CaCl2 濃度。

2. 將稀釋的樣品用 0.45μm 過濾器進行過濾。

3. 將 20CV 的緩沖液 A1 平衡 DEAE 柱。

4. 將澄清的稀釋細菌裂解液進行上樣。

5. 用 20 CV 的緩沖液 A1 對色譜柱進行流洗。

6. 用 20 CV 的緩沖液 A2 對色譜柱進行流洗。

7. 用 20 CV 的緩沖液 A3（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

圖 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的質粒 DNA 洗脫曲線

在高配體密度丁基修飾的（CIMmultus TM C4 HLD）整體柱上，利用疏水相互作用色譜柱（HIC）的拋光步驟，進一步從 超螺旋（SC）級 pDNA 中除去開環（OC）和線性 pDNA 亞型。

為了富集質粒 DNA 的超螺旋亞型，將 DEAE 洗脫液上樣到高配體密度丁基柱（C4 HLD）上。

該步驟進一步去除了雜質。

層析條件

*2 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。

層析方法

1. 調節來自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脫液，每 1 體積（V）洗脫液加入 3 體積（V）的 4M(NH4)2SO4。

2. 用 20CV 的緩沖液 B0 來平衡 C4 HLD 柱。

3. 將 DEAE 柱洗脫的 pDNA 組份上樣。

4. 用 20 CV 的緩沖液 B1 流洗色譜柱。

5. 用緩沖液 B2（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

6. 用 30 CV 的緩沖液 A1 再生色譜柱。

7. 加樣 3 次后，對柱子進行清洗。

圖 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分離超螺旋質粒 DNA

· 從 C4 HLD 柱洗脫的超螺旋