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C10000-穩轉細胞株構建
  • C10000-穩轉細胞株構建
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更新時間:2025-05-08 21:00:08

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慢病毒對照病毒,基因過表達病毒感染細胞。在感染細胞72小時后,通過加入并維持2ug/ml的puromycin殺死未被有效感染的細胞。從而在puromycin藥物的維持下終獲得穩定表達的穩定株

外源基因在細胞中的表達可分為兩大類,一類是瞬時表達,一類是穩定表達。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,雖然可以達到高水平的表達,但通常只持續幾天。后者外源DNA整合到宿主細胞染色體上,使宿主細胞可*表達目的基因。建立穩定細胞株,一般是根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物對靶細胞進行篩選。抗性標記基因有潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)和嘌呤霉素(puromycin),Hygromycin B、G418和puromycin進行選擇性篩選。傳統的穩定株篩選方法需要通過外源基因的瞬時轉染后對靶細胞進行篩選, 終獲得從單一細胞擴增起來的穩定細胞株, 該方法陽性率低,周期長,工作量大。慢病毒是一種RNA病毒,攜帶的外源基因在病毒感染細胞后需要逆轉錄為DNA,再整合到宿主細胞基因組以后才能表達。 利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來篩選穩定株的方法克服了傳統方法的弊端,可以在短時間內獲得高效率的穩定細胞株。篩選得到的細胞或者可穩定表達目的蛋白,用于蛋白的擴增和富集;或者得到穩定沉默特定基因的細胞株

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