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 DNA —>mRNA—> 蛋白

操作流程

1. 獲得目的基因,克隆或合成目的基因  

2. 載體構(gòu)建:,PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn))，PCR循環(huán)獲得所需基因片段。②通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成 cDNA 第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物.構(gòu)建重組表達(dá)載體載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。測序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞5.氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)。②按1:50或1:100 的比例稀釋過夜菌，一般轉(zhuǎn)接1 mL過夜培養(yǎng)物于100 mL (含100 ug/mL氨芐青霉素)LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.6-0.8(最好0.6，大約需3 h)。取10 ul樣品用于SDS-PAGE分析。接種含有重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5 mLLB液體培養(yǎng)基中(含100 ug/mL氨芐青霉素)，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。
②按1:50或1:100 的比例稀釋過夜菌，一般轉(zhuǎn)接1 mL過夜培養(yǎng)物于100 mL (含100 ug/mL氨芐青霉素)LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.6-0.8(最好0.6，大約需3 h)。取10 ul樣品用于SDS-PAGE分析。
③對照組不加誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3 h.
12 000 rpm離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
6.氯霆素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離、純化
NTA層析柱的準(zhǔn)備:在層析柱中加入1 mLNTA 介質(zhì)，并分別用8 mL去離子水，8 mL上樣緩沖液洗滌。
②重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5 mL上樣緩沖液，用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min，4C 12000 rpm離心 30 min，將上清吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。取10ul上清樣品用于SDS-PAGE分析。

3. 蛋白表達(dá)與純化③對照組不加誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3 h.12 000 rpm離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。6.氯霆素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離、純化NTA層析柱的準(zhǔn)備:在層析柱中加入1 mLNTA 介質(zhì)，并分別用8 mL去離子水，8 mL上樣緩沖液洗滌。

4. 蛋白的大量表達(dá)與純化②重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5 mL上樣緩沖液，用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min，4C 12000 rpm離心 30 min，將上清吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。取10ul上清樣品用于SDS-PAGE分析。