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PriCells: 樹突細胞的分離-用小鼠骨髓前體細胞培養樹突細胞
PriCells: 樹突細胞的分離-用小鼠骨髓前體細胞培養樹突細胞
實驗材料：
1. 6-7周齡小鼠（最好為雄性鼠，因為它們的骨頭比較粗大；運輸后需要休息至少5天；不要使用應激或脫水的老鼠）
2. 70%乙醇
3. 冰冷的以及室溫的RPMI-1640培養基（如Life Technologies）
4. 氯化銨溶液0.02mol/L Tris·Cl，pH7.2 /0.14mol/L NH4Cl
5. 裂解淋巴細胞的抗體（雜交瘤上清）（可選）。例如，雜交瘤RA3-3A1（B220抗體；ATCC號TIB146）、GK1.5（CD4抗體；ATCC號TIB207）、3.155（CD8抗體；ATCC號TIB211）、M5/114（MHCⅡ抗體；ATCC號TIB120）
6. 兔補體（Pel-Freez）
7. RPMI-5*培養基
8. 小鼠GM-CSF（mGM-CSF）：可以來源于純化的重組蛋白，也可來源于轉染小鼠GM-CSF基因的細胞系的條件培養基
9. 用于流式細胞檢測DC的抗體：如MHCⅡ類分子的雜交瘤上清（ATCC號TIB120）、B7-2/CD86的雜交瘤上清（Pharmingen）、DEC-205的抗體（ATCC號HB290）
10. 解剖用品
11. 無菌紗布墊
12. 100mm培養皿（如Falcon）
13. 3ml注射器25G，5/8in（1.58cm）針頭
14. 9in（23cm）巴氏吸管（填充棉花并高壓滅菌）
15. Nytex濾器（3-40/26；Tetko）
16. 15ml和50ml聚丙烯錐底管
17. 24孔培養板（如Corning）
實驗方法：
1. 取小鼠股骨和脛骨，保存在置于冰上的RPMI-1640培養基中，直到所有的小鼠準備完畢。去除骨頭上的肌肉（通常在無菌紗布墊操作）后，將干凈的骨頭置于新的平皿里。然后在含70%乙醇的培養皿里浸泡骨頭2min，最后用冷RPMI-1640培養基洗滌2遍。
2. 用剪刀剪去骨的兩端（骺）然后將其轉移到另外的培養皿中。用注射器吸取2ml RPMI-1640培養基沖洗骨髓腔以獲得骨髓。在另一培養皿里剁碎骨骺。將剁碎的骨骺以及從骨髓腔里沖洗出來的骨髓混合在一起，用吸管打碎團塊，將懸液通過篩網（去除顆粒）后收于15ml或者50ml的離心管里。
3. 加入3-10ml的氯化銨溶液裂解紅細胞。室溫靜置3min后，室溫，280g離心10min（1200r/min Beckman GH-3.7轉子），棄上清。
4. 去除淋巴細胞（可選）：將細胞配成1×107個細胞/ml，加入合適濃度的雜交瘤上清（通常1：20終濃度）和兔補體（通常1：17-1：20終濃度）。37℃水浴培養1h，每20min振蕩一次。
5. 用RPMI-1640洗滌骨髓細胞2次，室溫，280g離心10min。計數活細胞。用RPMI-5*培養基調整細胞濃度至1×106個細胞/ml。
6. 加入小鼠重組GM-CSF至終濃度為700-1000U/ml或者20ng/ml。將細胞懸液一般每只小鼠可以得到4×107-5×107個骨髓細胞（沒有去除淋巴細胞）按1ml/孔接種24孔板。
7. 每2天洗滌細胞一次，每次移出舊的培養基，然后傾斜24孔板用RPMI-1640輕輕地沿孔壁洗滌后吸出洗滌液，最后加入1ml新的含700-1000U/ml（約20 ng/ml）mGM-CSF的RPMI-5*培養基（步驟6）。
8. 可選：驗證聚集物的特征--MHCⅡ類分子存在于不成熟DC的胞內小室（MHCⅡ小室或者MⅡC）通過標記〔3H〕胸腺嘧啶，可發現10%-20%的細胞處于S期，用流式細胞儀分析，細胞中度表達膜MHCⅡ類分子，但是不表達B7-2/CD86共刺激分子。
9. 在第5-8天期間（此時已產生足夠的聚集體），用RPMI-1640或RPMI-5培養基輕輕吹打，將聚集體從貼壁的基質細胞上脫離下來（此后幾天一直會有聚集體產生）。收集脫離的細胞，室溫，280g離心10min，棄上清。用RPMI-5培養基重懸，最高濃度1×106個細胞/ml。然后鋪在直徑為100mm的培養皿中，每個培養皿10ml，最多鋪1×107個細胞。
10. 于細胞轉移后24-48h期間，每24h輕輕搖晃培養皿，收集非貼壁、非增殖、成熟的DC，轉移至另外的收集管中用于后期的研究。
11. 計數活細胞。用流式細胞儀或者用血細胞計數板計數大的形狀不規則的細胞來檢測DC得率（每只動物通常獲得5×106-10×106個細胞，≥60%表達成熟DC的表面標志）。