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PriCells: MSCs分化為礦化的成骨細(xì)胞

時(shí)間:2021-10-25 閱讀:265
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PriCells: MSCs分化為礦化的成骨細(xì)胞                                                                                     


試劑和材料:
1. *培養(yǎng)基(CCM):α-MEM:α-*基礎(chǔ)培養(yǎng)基,含谷氨酰胺,無(wú)核苷酸或脫氧核苷酸;添加:20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經(jīng)FBS雜交瘤純化,非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。過(guò)濾除菌。儲(chǔ)存于4℃,不超過(guò)2周;
2. BDM(骨分化培養(yǎng)基):CCM包含5mmol/L β-甘油磷酸,50μg/ml抗壞血酸-2-磷酸和1nmol/L地塞米松。過(guò)濾除菌;
3. PBSA;
4. 胰蛋白酶/EDTA;
5. 聚丙烯離心管,15ml和50ml;
6. 組織培養(yǎng)皿,6孔,孔面積為9.6cm2
7. ARS:蒸餾水配制1%ARS,用0.5N氫氧化氨調(diào)節(jié)pH值到4.1,過(guò)濾除菌;
8. 福爾馬林緩沖液,10%;
9. 改良的Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)器;


實(shí)驗(yàn)方法:
1. 從單層細(xì)胞中收集MSCs;
2. 向6孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入2ml CCM,共有1×104個(gè)細(xì)胞(適用于人或大鼠)。最終密度約1×103個(gè)細(xì)胞/cm2
3. 將上排3個(gè)孔標(biāo)記為“成骨",下排3個(gè)孔標(biāo)記為“陰性";
4. 在37℃,5%CO2環(huán)境下孵育,每隔兩天更換一次培養(yǎng)基,直到細(xì)胞達(dá)到7.%—80%匯合;
5. 達(dá)到所需的細(xì)胞密度時(shí),從孔中吸出*樣機(jī),向6孔培養(yǎng)板上排的孔中加入2ml BDM,向下排的孔中加入2ml CCM;
6. 在37℃,5%CO2環(huán)境下孵育,每隔兩天更換一次培養(yǎng)基。ARS檢測(cè)時(shí),于21天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色;
(1) 從培養(yǎng)箱中取出分化后的MSC,每孔中的單層細(xì)胞用2ml PBSA潤(rùn)洗兩次;
(2) 每孔中加入2ml福爾馬林,室溫固定單層細(xì)胞10min;
(3) 吸出福爾馬林,每孔中加入2ml PBSA潤(rùn)洗兩次后,再用2ml蒸餾水潤(rùn)洗一次;
(4) 加入2ml ARS溶液,室溫孵育30min;
(5) 過(guò)量蒸餾水潤(rùn)洗各孔,直到“陰性"孔中的背景染色最大限度地清除;
7. 用顯微鏡觀察標(biāo)記為“成骨"的單層細(xì)胞評(píng)價(jià)深紅色的程度。成骨分化達(dá)到令人滿(mǎn)意的水平時(shí),單層細(xì)胞ARS著色面積超過(guò)50%。此時(shí),單層細(xì)胞可在4℃水中最多存放7天。或者,ARS可從著色的單層細(xì)胞中提取出來(lái),用先前描述的方案進(jìn)行測(cè)定;


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