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武漢原生原代生物醫藥科技有限公司

PriCells: 用碘克沙醇梯度溶液從哺乳動物肝臟中分離細胞核的

時間:2021-11-2 閱讀:429
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試劑和器材: 
1. OptiPrepTM(600g碘克沙醇,ρ=1.32g/ml);
2. OptiPrepTM稀釋劑(OptiPrepTM diluent,OD):150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、120mmol/L三jia基甘氨酸-KOH,pH7.8;
3. 勻漿介質(HM):0.25mol/L蔗糖、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、20mmol/L三jia基甘氨酸-KOH,pH7.8;按要求向OptiPrepTM稀釋劑和勻漿介質中加入蛋白酶抑制劑
4. 高轉矩橋式電動機(半導體開關控制);
5. Potter-Elvehjem勻漿器,20—40ml,孔隙約0.07mm;
6. 高速離心機,帶可容納15—50ml離心管的吊桶式轉子;
7. 注射器,帶金屬套管針(內徑約0.8mm);

8. 尼龍濾網;


實驗方法:
   所有操作在0—4℃下進行。
1. 制備500g/L碘克沙醇工作液:每5倍體積OptiPrepTM用1倍體積的OptiPrepTM稀釋劑來稀釋;
2. 梯度溶液:用勻漿介質(分別為6倍體積+4倍體積和7倍體積+3倍體積)來稀釋500g/L碘克沙醇工作液以制備300g/L和350g/L的兩種碘克沙醇梯度溶液。保持于冰上。
3. 切除肝臟并用剪刀剪切成微小碎塊;
4. 將大約一半肝臟轉移到Potter-Elvehjem勻漿器的20ml勻漿介質中,并用研杵研磨約8次,在約500r/min轉速下旋轉以破碎組織;
5. 對另一半肝臟切碎物重復以上操作;
6. 用尼龍濾網過濾;
7. 通過與等體積的500g/L碘克沙醇工作液混合將勻漿液調整到250g/L碘克沙醇;
8. 將10—15ml勻漿液轉移到50ml管中,從300g/L和350g/L的碘克沙醇梯度溶液中各取10ml加到勻漿液之下;
9. 在100000g下離心20min;
10. 細胞核在300g/L和350g/L碘克沙醇界面上成帶,用注射器和金屬套管針吸取細胞核;
11. 用2倍體積的勻漿介質稀釋懸液,在2000g下離心10min沉淀細胞核的;



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