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武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司

PriCells: 原代細(xì)胞核孔復(fù)合物的分離

時(shí)間:2021-11-3 閱讀:230
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PriCells: 原代細(xì)胞核孔復(fù)合物的分離                                                           


試劑和器材: 
1. 肝素;
2. 苯j(luò)ia基磺酰氟(PMSF)(溶于乙醇中配制成1mol/L儲(chǔ)存液);
3. 純化的核膜;
4. 提取緩沖液(EB):含1%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100的10mmol/L Tris-HCl,(pH7.4)、0.1mmol/L苯j(luò)ia基磺酰氟;
5. Tris緩沖液:2mmol/L Tris-HCl、pH7.4,10mmol/L Tris-HCl、pH7.4;
6. 梯度溶液:0.25mol/L蔗糖溶液和1.5mol/L蔗糖溶液溶于10mmol/L Tris-HCl,pH7.4;
7. 所有溶液須含0.1mmol/L苯j(luò)ia基磺酰氟;
8. 梯度收集器;
9. 高速離心機(jī),配有固定角轉(zhuǎn)子和離心管;
10. 超速離心機(jī),配有固定角和吊桶式轉(zhuǎn)子、離心管;
11. 超聲發(fā)生器(探針型,帶有定時(shí)器);
12. 雙室梯度儀或者Gradient MasterTM;


實(shí)驗(yàn)方法:
1. 采用提取緩沖液,4℃抽提原代細(xì)胞核膜30min;
2. 20000g離心30min,松散地沉淀核孔復(fù)合物薄片。用2mmol/L Tris-HCl、(pH7.4)小心重懸沉淀,再次離心;
3. 用10mmol/L的Tris-HCl(pH7.4)小體積重懸沉淀(如1ml),并在冰浴上超聲處理。為防止樣品產(chǎn)熱,超聲過程中重復(fù)短時(shí)間處理(如10s),中間間隔冷卻;
4. 通過制備負(fù)染標(biāo)本,如用20g/L鉬酸銨(pH7.0)或50g/L鉬酸銨-1g/L海藻糖(pH7.0)進(jìn)行電鏡分析,及時(shí)監(jiān)測(cè)核膜的破裂以及核孔復(fù)合物的釋放。如果必要的話,繼續(xù)超聲處理;
5. 將樣品加于0.25—1.5mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCl(pH7.4)線性密度梯度溶液上,4℃、約60000g離心1—2h;
6. 從蔗糖梯度溶液中部分收集;
7. 采用負(fù)染電鏡檢測(cè)收集各成分內(nèi)容物,以確定核孔復(fù)合物沉淀在蔗糖梯度溶液中的位置,并進(jìn)行完整性分析;
8. 對(duì)梯度成分進(jìn)行SDS-PAGE,檢測(cè)蛋白分離情況;


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