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武漢原生原代生物醫藥科技有限公司

PriCells: 從組織和培養細胞中制備輕線粒體組分

時間:2021-11-4 閱讀:261
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PriCells: 從組織和培養細胞中制備輕線粒體組分


試劑和器材: 
1. 勻漿介質:0.25mol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L Hepes-NaOH,pH7.4;
2. 按要求向溶液加入蛋白酶抑制劑;
3. 磷酸鹽緩沖液;
4. 低速冷凍離心機,配有30—40ml離心管的吊桶式離心轉子;
5. 高速離心機,配有30—40ml離心管的固定角轉子;
6. 用于肝臟:Potter-Elvehjem(聚四氟乙烯樹脂和玻璃)勻漿器(30—40ml),連接高轉矩橋式電動機(半導體開關控制);
7. 用于細胞:滾珠軸承勻漿器或帶23號或25號針頭的注射器;
8. Dounce勻漿器(寬松配制,Wheaton B型);
9. 20ml規格注射器(內徑約0.8mm),帶金屬套管針;


實驗方法:
   所有操作須在0—4℃下進行。
1. 對肝臟:用剪刀非常細微地剪碎組織(或使用組織切碎機),用勻漿介質轉移到Potter-Elvehjem勻漿器中(每2.5g組織使用10ml介質)。研杵研磨6次左右進行勻漿(500—700r/min);
2. 對細胞:在5ml磷酸鹽緩沖液中洗滌(1—3)×108個細胞,再換用勻漿介質進行洗滌。在3ml勻漿介質中混懸細胞,在滾珠軸承勻漿器中來回5次勻漿;
3. 800g下離心10min,沉淀核、細胞碎屑和未破碎細胞;
4. 傾倒或吸取(使用針管和注射器)上清,置于冰上;
5. 在寬松配制Dounce勻漿器中研杵研磨2—3次進行勻漿,使用10ml勻漿介質重懸沉淀(細胞則使用5ml);
6. 重復離心,合并上清;
7. 將合并的上清在3000g下離心10min;
8. 將第7步得到的上清在15000g下離心10min;
9. 用10ml(細胞對應5ml)勻漿介質重懸輕線粒體沉淀,在寬松配制Dounce勻漿器中用研杵輕輕地研磨2—3次;
10. 15000g下離心10min;
11. 在適當的介質中重懸沉淀用于分析或進一步處理;

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