2009年Hans Clevers實驗室對腸道培養體系進行了開創性地研究（Sato et al.,2009 )，2011年Sato等人發表了第一個描述完整分離腸隱窩以及后續培養的研究方案（Sato et al.,2011)。為了降低培養成本、簡化培養流程，后續有多個文獻報道了對此培養方法的改進（Mache et al.,2013;Vandussen et al.,2015;Zietek et al.,2015)，包括降低一些生長因子的濃度，或利用重組細胞系來生產Wnt3a、Noggin和R-Spondin1的條件培養基等。

目前常用的隱窩分離方法有兩種。一種方法是利用EDTA從基底膜上分離隱窩，另一種方法則采用膠原酶消化腸道組織。本文將詳細闡述兩種方法提取小鼠及人源組織中隱窩的步驟及要點。

48孔細胞培養板、離心管（50mL)、細胞培養皿（6cm和10cm）、移液器（規格為10μL、200μL、1000μL和5000μL）、無菌吸頭（規格為10μL、200μL 、1000μL和5000μL）、無菌鑷子、無菌組織剪、70μm細胞過濾器、手術刀片。

MatrigengeL Matrix（推薦貨號：082703/082755）；小鼠小腸類器官培養試劑盒（推薦貨號：MA-0817H006）；類器官培養防黏附潤洗液；類器官回收液（用于傳代培養）；75%乙醇溶液；DPBS；雙抗（青霉素、鏈霉素）；基礎培養基；EDTA溶液（pH=8.0）。

· 配制5mMol/L EDTA溶液：10mL預冷DPBS溶液中加入

· 100μL0.5M EDTA溶液pH8.0，置于冰上備用。

小鼠小腸類器官原代建立準備物品

（1）按倫理規定處死小鼠后，表面噴灑酒精殺菌。在無菌條件下取出近胃端3～10cm腸組織，用鑷子盡可能去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預冷的含雙抗的DPBS溶液中。

小鼠小腸剪取

（2）使用手術剪將腸管剪開，蕩洗2遍后，腸腔面朝上，一只手使用手術鑷夾住腸組織一端，另一只手使用手術刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養皿中清洗，重復清洗2次。將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬，轉移至新的培養皿中，用DPBS清洗2遍。

小鼠小腸刮絨毛

（3）將清洗好的腸段轉移至含5mMol/L EDTA的預冷DPBS中消化，置于4℃孵育20～30min。消化20分鐘可用移液器輕柔吹打腸段，取上清顯微鏡下觀察，待上清出現完整隱窩即可終止消化，若無隱窩可適當延長消化時間，盡量不超過30分鐘。

（4）消化完成后，將組織碎片轉移到新的含DPBS的培養皿中清洗，重復2次以去除EDTA。

（5）用5mL移液管在預冷的0.1%BSA的DPBS的培養皿或50mL離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復穿過移液管尖以產生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當可以看到大量的隱窩樣結構后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液進行70μm濾網過濾。

濾網過濾后的組織懸液鏡檢圖

（6）收集穿過濾網的組織懸液，300g離心力4℃離心3min。

（7）棄上清，使用1mL0.1%BSA的DPBS重懸組織沉淀，取20μl懸液進行鏡檢和隱窩計數，計數完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300g離心力4℃離心3min，棄上清后置于冰上。

（1）用適量的Matrigengel Matrix重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每10μL Matrigengel Matrix懸液包含70至100個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超30以避免Matrigengel Matrix過早凝固。（Matrigengel Matrix稀釋比例應在70%以上以保證培養過程中Matrigengel Matrix的結構穩定性）。

（2）將Matrigengel Matrix和組織細胞的混合懸液點入48孔板底部正中央，每孔15μL左右，避免懸液接觸孔板側壁。（為防止Matrigengel Matrix室溫凝固，此步驟應盡快完成）。

基質膠與細胞混合液點板

（3）將接種完成后的培養板置于37℃二氧化碳恒溫培養箱中，孵育15min左右待Matrigengel Matrix凝固。

（4）待Matrigengel Matrix 完全凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的小鼠小腸類器官完全培養基，48孔板每孔250μL，避免破壞已凝固結構。

（5）將培養板置于37℃二氧化碳培養箱中培養。

（6）每3天更換一次培養基，更換培養基時應避免破壞Matrigengel Matrix，密切監測類器官生長狀態。

該實驗流程適用于人腸壁全層組織，大約需10cm²大小，所需試劑體積及孵育時間需根據實際組織的大小作出相應調整。

剪刀、鑷子(鈍頭)；培養皿；載玻片；50mL離心管；1.5mL EP管；70μm細胞篩；96孔板(平底)；離心機；搖床；1000/100μL槍頭；顯微鏡；24孔板

不含Ca²+/Mg²+的HBSS；0.5M EDTA溶液；青霉素/鏈霉素(雙抗，AA)；模基基質膠；模基生物人小腸類器官培養基套裝

· MatrigengeL Matrix（4℃化凍）；

· 模基生物預冷盒；

· HBSS(4℃預冷過夜)；

· 1000/100μL槍頭(4℃預冷過夜)；

· 離心機預冷(4℃)；冰盒；

· 制備人源隱窩培養基(hCCM)并置于室溫或培養箱內預熱；

· 制備基礎培養基(BCM)(4℃預冷)；

· 將24孔板置于培養箱預熱。

· 1個培養皿；

· 2個50mL離心管內加入30mL HBSS(加入1%雙抗)，標記樣本編號，置于4℃預冷；

· 5個50mL離心管內加入20mL HBSS置于4℃預冷，標記樣本及組分編號；

· 2個50mL離心管(標記樣本編號)；

· 1~2個70μm細胞篩；

相較于EDTA法，該方法成本稍低，無需選擇特定的組分進行培養也可培養出大量體積較大的隱窩，但膠原酶酶法需要嚴格的實驗流程，同時有被成纖維細胞污染的風險。

· 2個培養皿；

· 1~2個50mL離心管內加入20mL PBS(加入1%雙抗),標記小鼠編號，置于4℃ 預冷；

· 1~2個50mL離心管，標記小鼠編號；

· 6個15mL離心管，標記小鼠編號；

· 稱取適量的膠原酶XI于50mL離心管中，-20℃保存

·  1個70μm細胞篩；

（1）按照小鼠腸隱窩分離流程準備整個小腸樣本。

（2）將小腸樣本移至裝有預冷PBS的培養皿中。將小腸切成腸段以便操作，用剪刀縱向剪開小腸，將小腸組織移至加入PBS的50mL離心管中，劇烈搖晃離心管5min以清洗組織。這個步驟重復多次直至清除小腸組織中的黏液及碎片

腸段清洗

（3）將組織移至裝有預冷PBS的培養皿中，PBS僅需覆蓋培養皿底部，用鑷子及刀片將組織切成小塊（約1mm²）。

（4）用5~10mL移液器將組織塊和PBS移至15mL離心管中，加入預冷的PBS至10mL, 將離心管翻轉5次，靜置使組織塊沉降。小心棄上清，再次加入10mL預冷的PBS，重復清洗步驟直至上清澄清(大約需4次)。

準備膠原酶XI溶液：將14mg膠原酶XI加入預熱的40mL DMEM 6546，無菌過濾膠原酶溶液至50mL離心管中，置于37℃水浴鍋中。

（5）棄去上清，盡可能不殘留PBS，加入10mL預熱的膠原酶XI溶液，混勻。

（6）在37℃水浴中孵育4.5min，小心翻轉離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，棄上清。

（7）加入10mL預熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育4.5min，搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，棄上清。

（8）加入10mL預熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育15min，分別在4.5min、9.5min、14.5min后搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，棄上清。

（9）加入10mL預熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育15min，分別在4.5min、9.5min、14.5min后搖晃離心管30s，靜置45秒使組織塊沉降。

（10）取出上清移至新的15mL離心管中，100g、4℃離心2min，棄上清，10mL預冷PBS重懸沉淀。

（11）100g、4℃離心2min，棄上清，10mL預冷PBS重懸沉淀，將重懸液通過70μm細胞篩至適當標記的50mL離心管中。

（12）取10μL重懸液于顯微鏡下進行隱窩計數，估算隱窩總個數(10mL 中隱窩總個數=10μL中隱窩個數×1000)。按每孔種100~200個隱窩計算所需重懸液體積，移至適當標記的50mL離心管中。

（13）按照小鼠腸隱窩提取流程中的第12~14步驟進行后續實驗。

（1）按照小鼠腸隱窩分離流程準備結腸樣本。

（2）按照小腸隱窩分離流程中第2~4步驟進行實驗。

準備膠原酶XI溶液：將14mg膠原酶XI加入預熱的40mL DMEM  6546，無菌過濾膠原酶溶液至50mL離心管中，置于在37℃水浴鍋中。

（3）棄上清，盡可能不殘留PBS，加入10mL預熱的膠原酶XI溶液，混勻。

（4）在37℃水浴中孵育9.5min，劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，棄上清。

（5）加入10mL預熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育14.5min，劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，棄上清。

（6）加入10mL預熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育15min，分別在4.5min、9.5min、14.5min后搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分1，將其移至適當標記的15mL離心管中。

（7）加入10mL預熱的膠原酶XI溶液，混勻；在37℃水浴中孵育15min，分別在4.5min、9.5min、14.5min后搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分2。

同時，將組分1于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預冷PBS重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預冷PBS重懸沉淀，置于冰上。

（8）將組分2的上清移至15mL離心管中，于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預冷PBS 重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預冷PBS重懸沉淀。

（9）將組分1重懸液與組分2重懸液混合得到10mL隱窩懸液，通過70μm細胞篩至適當標記的50mL離心管中。

（10）取10μL重懸液于顯微鏡下進行隱窩計數，估算隱窩總個數(10mL中隱窩總個數=10μL中隱窩個數×1000)。按每孔種100~200個隱窩計算所需重懸液體積，移至適當標記的50mL離心管中。

（11）按照小鼠腸隱窩提取流程中的第12~14步驟進行后續實驗。

使用膠原酶分離人源腸隱窩的實驗流程與小鼠腸隱窩的流程非常類似，器械、試劑、溶液及準備工作與小鼠腸隱窩的分離相同。下述的實驗方案適用于約5.5cm²大小的腸組織樣本。

（1）用預冷的PBS清洗腸組織。

（2）將組織移至裝有預冷PBS的培養皿中，用剪刀和鑷子小心去除肌層及黏附的結締組織。

（3）棄PBS，取新的預冷PBS清洗組織，再重復2次。

（4）按照小腸隱窩分離流程中第3~5步驟進行實驗，膠原酶溶液中膠原酶XI的使用劑量如下：

· 小腸組織：15mg/40mL DMEM 6546

· 大腸組織：20mg/40mL DMEM 6546

（5）在37℃水浴中孵育9.5min，劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分1，將其移至適當標記的15mL離心管中。

（6）用10mL預熱的膠原酶XI溶液重懸組分1的沉淀，混勻后在37℃水浴中孵育9.5min,劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分2，將其移至適當標記的15mL離心管中。

同時，將組分1于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預冷PBS重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預冷PBS重懸沉淀，置于冰上。

（7）用10mL預熱的膠原酶XI溶液重懸組分2的沉淀，混勻后在37℃水浴中孵育9.5min，劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分3，將其移至適當標記的15mL離心管中。

同時，將組分2于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預冷PBS重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預冷PBS重懸沉淀，置于冰上。

（8）用10mL預熱的膠原酶XI溶液重懸組分3的沉淀，混勻后在37℃水浴中孵育9.5min，劇烈搖晃離心管30s，靜置45s使組織塊沉降，該上清即為組分4，將其移至適當標記的15mL離心管中。

同時，將組分3于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預冷PBS重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預冷PBS重懸沉淀，置于冰上。

（9）將組分4的上清于100g、4℃離心2min，棄上清；10mL預冷PBS重懸沉淀，再次于100g、4℃離心2min，棄上清；5mL預冷PBS重懸沉淀。

（10）將組分1~4的重懸液混合后，通過70μm細胞篩至適當標記的50mL離心管中，并于350g、4℃離心3min。

（11）按照人源腸隱窩提取流程中的第13~16步驟進行后續實驗。

小鼠和人源類器官培養的主要區別在于其培養基組分的不同。小鼠小腸類器官培養所需要的補充因子最少，人源類器官培養需要多個生長因子和抑制劑以維持生長，這對于前幾天的培養尤為重要。在培養基中加入Wnt3a可抑制分化，增加干細胞/擴增細胞的比例，促進類器官囊泡樣生長。減少Wnt3a用量、撤掉SB202190或加入可抑制Notch通路的γ-分泌酶抑制劑可誘導類器官向不同的腸上皮細胞譜系分化。

添加與不添加Wnt3a的培養基培養下小鼠小腸類器官生長情況對比圖

48孔細胞培養板、離心管（50mL)、細胞培養皿（6cm和10cm）、移液器（規格為10μL、200μL、1000μL和5000μL）、無菌吸頭（規格為10μL、200μL 、1000μL和5000μL）。

模基生物基質膠；類器官培養防黏附潤洗液；類器官回收液（用于傳代培養）。

（1）將培養板置于冰上，吸出類器官培養基，不要破壞含有類器官的類器官培養基質膠。

（2）在每個孔中加入10倍體積冷的（2~8°C) 類器官回收液。如，取5μl基質膠，加入50μl回收液。

（3）在2~8°C或冰上孵育50分鐘，用手輕輕搖動。（孵育10~15分鐘后，您可以用細胞刮板或移液管輕輕取出基質膠圓頂，以加速恢復過程。一旦孔底的基質膠圓頂狀形狀消失，類器官開始漂浮在溶液中，孵育即完成。）

（4）輕輕地將孔內的內容物轉移到適當的離心管中，單層類器官應格外小心處理，因為細胞很容易脫落。

（5）以25~50xg的離心力，在2~8°C下離心，離心管3分鐘，將類器官離散成顆粒，并丟棄上清液。

（6）用10倍類器官基礎培養基在室溫下清洗一次類器官，重復上面的第5步。

（7）根據密度加入對應批次的細胞外基質重懸類器官碎片，冰上混勻，取15μL混合懸液點入48孔板中央。

（8）將接種完成后的培養板37℃凝固15min左右，沿壁緩慢加入250μL/孔類器官完全培養基。

（9）將細胞培養板放入培養箱中進行培養，每天于倒置顯微鏡下觀察類器官的生長狀態，每2～3天更換完全培養基。（此時顯微鏡下可觀察到，細胞碎片均已清除。）

模基生物活組織細胞保存液

（5）在分離過程中使用的離心管和移液管使用前用類器官培養防粘附潤洗液潤洗，以便提升隱窩回收率。

模基生物類器官培養潤洗液

（6）類器官回收液需提前預冷至2-8°C。

模基生物類器官回收液

常用的實驗方法如定量PCR、蛋白印跡、流式細胞術或免疫熒光(IF)/免疫組織化學 (IHC) 染色等均可用于分析腸道類器官。類器官既可作為細胞團新鮮固定，也可以包埋在OCT或石蠟中從而廣泛應用于抗體檢測。一般來說，腸道類器官培養的驗證主要指在mRNA或蛋白質水平上檢測不同亞型腸上皮細胞（干細胞、潘氏細胞、杯狀細胞、腸吸收 細胞、腸內分泌細胞、tuft細胞）標志物的表達。