一、抗原修復(fù)技術(shù)
原理：通過高溫（熱修復(fù)）或蛋白酶K處理，破壞交聯(lián)鍵，暴露被封閉的抗原表位。
方法：
熱修復(fù)：將切片浸入pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，微波加熱至95℃維持15分鐘。
酶消化：使用0.05%-0.1%胰蛋白酶37℃處理10-30分鐘（適用于疏松組織）。
二、優(yōu)化固定條件
固定劑選擇：
固定劑 | 適用染色類型 | 缺點(diǎn) |
4%多聚甲醛 | 常規(guī)免疫組化 | 強(qiáng)交聯(lián)，需抗原修復(fù) |
乙醇/丙酮 | 細(xì)胞涂片、冰凍切片 | 穿透力差，易致細(xì)胞收縮 |
鋅鹽固定液 | 磷酸化蛋白保留 | 成本高，保存期短 |
固定時間控制：
小塊組織（<5mm3）固定不超過24小時，避免過度交聯(lián)。
三、穿透增強(qiáng)處理
去垢劑應(yīng)用：0.1%-0.3% Triton X-100處理10分鐘，增加細(xì)胞膜通透性。
凍融循環(huán)：將組織反復(fù)凍融（-80℃?室溫），破壞致密結(jié)構(gòu)（慎用于脆弱樣本）。
四、封閉內(nèi)源性干擾物
內(nèi)源性過氧化物酶：3% H?O?室溫處理10分鐘。
自發(fā)熒光：0.1% Sudan Black B乙醇溶液浸泡10分鐘（適用于醛基固定樣本）。
五、試劑與染色方案適配
抗體驗證：選擇經(jīng)固定組織驗證的一抗（查閱文獻(xiàn)或說明書標(biāo)注“IHC/IF validated"）。
染料適配：
核酸染料：優(yōu)先選用抗固定型染料（如DAPI替代Hoechst）。
熒光標(biāo)記：避免使用與自發(fā)熒光波長重疊的探針（如Cy5替代FITC）。
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