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無縫克隆試劑盒-單片段
貨號：D0205P
存儲溫度 ：-20°C
產品組分
組分/規格 | 50T | 250T |
DNA Assembly Mix Single PLUS | 500μ l | 5 × 500ul |
無縫克隆試劑盒-單片段
產品簡介
基于重組原理的無縫克隆技術，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依 據 DNA 片段與線性化載體末端的 15~25 nt 同源序列的重組 ，可將插入片段克隆至任意載體的任意位點，載體自連背景 極低 ，是一種簡單、快速、高效的 DNA 定向克隆技術。
DNA Assembly Mix Single Plus 無縫克隆試劑盒，專為單片段優化，最快僅需5 分鐘即可完成單片段 重組 ，且陽性率高于95%。DNA Assembly Mix Single Plus 相較于 DNA Assembly Mix Plus
(Cat:D0204P) ，不依賴連接酶，組分更簡單，對未純化的 PCR 產物兼容性更強。同時，由于不含連接酶，依靠大腸桿菌本身的修復系統，保真度更高。
產品應用
快速克隆；單片段 DNA 組裝；DNA 定點突變。
實驗步驟
1、實驗流程概要
注 1：經雙酶切進行線性化的載體無需去磷酸化，經單酶切則需要去磷酸化；
注 2：酶切完成后，應將快速內切酶失活或對目的產物純化后再用于重組反 應。
注 3 ：載體膠回收時建議長時間電泳與殘留的環狀質粒區分開后再切膠， 以減少假陽性率。
2. 線性化克隆載體制備
選擇合適的克隆位點，對載體進行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向PCR擴增完成。
① 酶切制備
推薦使用 LabFD™快速內切酶進行雙酶切 ，使載體線性化wan全，以降低轉化背景(假陽性克隆)；若使用單酶切進行線性化，可以適當延長酶切時間以減少環狀質粒殘留。
② 反向 PCR 擴增制備
為減少擴增突變的引入，推薦使用高保真 PCR Mix 進行擴 增。推薦使用預線性化質粒作為模板 ，以減少環狀質粒模板殘 留對克隆陽性率的影響。
注 1 ： PCR 產物無非特異性條帶時 ，推薦使用 LabFD™ DpnI ( 貨號 ： F5585S) 1 μl 加入 50 μl PCR 產物中 37℃ 1 h ，80℃ 20 min 消化 質粒模板即可用于重組反應；反之建議將 PCR 產物膠回收后使用。
3. 插入片段 PCR 引物設計
PCR 引物的 5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載 體）末端同源的 15~25 nt（推薦 18nt）序列。假如載體為粘 性末端 ，且 3'端突出 ，則引物設計必須包含突出部分；若 5'端 突出 ，則引物設計可以包含突出部分 ，也可以不包含。
插入片段正向擴增引物：
5'—上游載體末端同源序列+酶切位點（可選） + 基因特
異性正向擴增序列—3' 插入片段反向擴增引物：
3'—基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可選）+下游載 體末端同源序列—5'
注 1：盡量選擇無重復序列且 GC 含量均勻的區域進行克隆 ，當載體克隆位 點上下游 25 nt 區域內 GC 含量為 40% ~60%時 ，重組效lv最高；
注 2 ：包含多個重復序列的片段無法采用無縫克隆的策略進行連接。
注 3 ：包含多個重復序列的片段無法采用無縫克隆的策略進行連接。
4. 插入片段的 PCR 擴增
推薦使用高保真 PCR Mix（ Cat：T1211）進行擴增 ，以減少擴增突變的引入。建議使用純化后的 PCR 產物進行無縫克 隆反應，若 PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴增產物， 可直接使用 ，但加樣體積不應超過總反應體積的 20%。
5. 重組反應
① 于冰水浴中配置以下反應體系：
組分 | 反應體系 | 陰性對照 c |
DNA Assembly Mix Single Plus | 10 μ l | 10 μ l |
線性化載體 a | 50 ~200 ng | 50 ~100 ng |
插入片段 b | 10 ~200 ng | - |
ddH2O | To 20 μ l | |
a.最適載體用量(ng) =0.02×載體堿基對數 ，即 0.03 pmol。
b.插入單片段 ，最適片段用量（ ng） = 0.04×片段堿基對數。
c.陰性對照可用來確認線性化載體中是否有環狀質粒殘留 ，推 薦進行。
注 1 ：若插入單片段長度大于載體 ，則應互換載體與插入片段用量；
注 2 ：若插入片段長度小于 200 bp ，則插入片段應使用 5 倍載體用量；
注 3：若按上述公式計算得到的用量超過最di/最高值，則建議直接按最di/ 最高用量使用；
注 4 ：載體片段過長、插入片段過長或片段數過多 ，克隆菌落數和陽性率 均會降低。
注 5 ：單點突變按照最適載體用量加入體系。
重組反應體系配制完成后 ，用移液槍輕輕吸打混勻各組 分 ，避免產生氣泡 ，切勿渦旋。
② 將反應體系置于 50℃ , 反應 5~15min。
注 1 ：推薦使用 PCR 儀等溫控比較精準的儀器進行反應 ，反應時間不足 克隆效率均會降低；
注 2 ： 50℃反應完成后 ，建議進行瞬時離心 ，將反應液收集至管底。
③ 將反應液離心管置于冰上冷卻 ，之后進行轉化或者儲存于-20℃。
注 1 ：-20℃儲存的重組產物 ，建議在 1 周內使用。
6. 重組產物轉化
取 10μ l 反應液，加入到 100μ l 感受態細胞中，緩慢吸打混勻，冰上放置 30 min。42℃熱激 60 s，冰浴 5 min。加 500μl SOC 或 LB 培養基 ，37℃振蕩培養 50~60 min（200 rpm）。將菌液均勻涂布在含有對應抗生素的平板上，倒置于 37℃過夜培養。
注 1 ：不同感受態細胞最后的克隆陽性率會有所差別 ，推薦使用轉化效 率 >108 CFU/μg 的感受態細胞；
注 2 ：菌落數取決于 PCR 產物與線性化載體的數量和純度；
7. 陽性克隆檢測
挑取單菌落至 10μ l ddH2O 中混勻 ，95℃裂解 10 min 后，取 1μ l 裂解液作為模板，進行菌落 PCR 鑒定(Cat：T0214)， 或將單菌落接種至抗性培養基中培養過夜后，提取質粒進行 酶切鑒定。
注 1 ：菌落 PCR 時建議至少使用一條通用引物 ，避免假陽性結果；
注 2 ：必要時可進一步對陽性結果進行測序鑒定。
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