您好, 歡迎來到化工儀器網
20
原代神經元的磁輔助轉染
實驗原理
磁轉染TM 是一種新穎、簡單而高效的細胞體外或體內轉染方法。這項技術利用磁力來驅動結合了磁性粒子的核酸進入靶細胞，從而使細胞能在幾分鐘之內獲得*劑量的RNA或DNA，且各細胞獲得量基本一致。NeuroMag是一個專為初級神經細胞和神經細胞系的高效率轉染而設計的磁性納米粒子配方，是神經科學研究中一種理想的轉染試劑。
如今可以非常高效地將各類核酸如DNA、RNA或寡核苷酸轉染進初級神經元和永生化神經細胞中，特別是原代海馬細胞或皮質激素神經元細胞。NeuroMag兼容于血清，可以用于瞬時和穩定轉染，是一種非常穩定，可應用的和僅用于研究目的技術。
實驗試劑
1. 分離液：含0.25％D-葡萄糖的HBSS（無鈣，鎂），保持在4°C，現配現用。
2. 培養基：MEM中加入10％的Nu-血清，15mM的pH值7.2的HEPES，0.45％葡萄糖，1mM丙酮酸鈉，2mM的L-谷氨酰胺，10 IU/ml的青-鏈霉素。
3. 營養培養基：MEM中加入2%的B27，15mM的HEPES，葡萄糖0.45％，1mM的丙酮酸鈉，2mM谷氨酰胺。
實驗設備
組織培養容器準備：
1. 將水溶性多聚L-賴氨酸（Sigma公司，P-1520）0.1 mg/mL溶于水中（分裝和存儲在-20°C）。
2. 將蓋玻片或培養皿用多聚L-賴氨酸覆蓋。
3. 37°C孵育過夜。
4. 水沖洗兩次。
5. 在無菌層流罩中干燥
實驗材料
海馬神經元細胞或神經細胞系
實驗步驟
1. 細胞
1) 原代神經元細胞：一般來說培養了7至21天的細胞都可以進行實驗，但體外培養天數(DIV)為10-15天(依據不同的培養條件)的細胞用來實驗。轉染前24小時更換50％的培養基。
2) 細胞系：于轉染實驗的前一天準備。
2. DNA / NeuroMag復合物的制備
1) NeuroMag：渦旋并適量加入至微管中。
2) DNA：稀釋數量的DNA至50~700微升的無血清和補充的培養基中
3) 將上述DNA溶液加入到NeuroMag溶液中，渦旋或吹打后在室溫下孵育15至20分鐘。
3. 轉染
1) 將NeuroMag / DNA復合物逐滴添加到培養的細胞(細胞> 10 DIV時，生長于營養培養基中，如果<10DIV，則培養于培養基中)，輕拍培養板以確保均勻分布，于15分鐘內置于磁板之上。
2) 移除磁板。
3) 細胞在37°C 標準條件下于CO2 培養箱中培養，直到用于評價轉基因表達(24小時至7天)。
4) 方法的優化
雖然上述快速方法轉染效率較高，但在特定的細胞系或原代細胞培養中，可能需要優化如下幾個參數以獲得最高的轉染效率：核酸的劑量、NeuroMag與核酸的比例、細胞密度和孵化時間。建議您一次優化一個參數。
a. 優化DNA的量
為達到最佳的轉染效率，DNA的量可以增加或減少。重要的是要始終保持不斷優化過程中的細胞數和培養時間。調整DNA最佳量時需要維持一個NeuroMag與DNA的固定比例(每微克DNA用3.5μg的NeuroMag)，在建議的范圍進行調整。
b. NeuroMag / DNA比值的優化
首先保持一個固定數量的DNA(根據您的培養皿中，細胞數量和以前的優化結果)，然后在2至5μL的范圍內調整每微克DNA中NeuroMag的量。
c. 細胞數量
細胞數量(密度)也是一個重要的參數，為達到良好的轉染效率，根據所使用的細胞進行調整的最佳調整。合適的細胞密度取決于增長率和細胞的培養條件，同等條件下，較好的細胞融合度比低細胞密度好。
d. 時間：
尋找轉染與細胞基因活性檢測，如啟動子活性，表達產物等之間的孵育時間，可通過檢測轉染24小時后到7天之間的基因產物來監測轉染效率。報告基因如綠色熒光蛋白，β-半乳糖苷酶，堿性磷酸酶或熒光素酶可以用來定量測量基因表達。
5) 共轉染
在對多個質粒DNA進行共轉染時，將每個質粒取相同數量進行混合，再依如上所述條件進行轉染。例如，如果你有兩個DNA質粒，則每質粒取1微克，再與7μL的NeuroMag混合，進行實驗。
6) 共轉染的選擇
共轉染只能實現順序轉染，而不能同時進行。因此，一個細胞在轉染質粒DNA4小時至24小時以后可以與其他質粒DNA再進行轉染。兩步轉染之間可以更換培養基。
注意事項
1. DNA和 NeuroMag溶液在使用前應回復至室溫，并輕柔渦旋。每微克DNA使用3.5µL的NeuroMag并實驗需要來進優化。
2. 神經細胞系：建議在轉染前一天將細胞培養于玻片上。合適的細胞密度取決于增長率和細胞的條件。在轉染期間細胞不應該少于60％的融合度（細胞覆蓋生長表面的百分比）。
3. 細胞密度是實現良好的轉染與低毒性的一個重要的參數，合適的細胞密度將取決于增長速度和細胞的培養條件。