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熒光定量pcr羅氏480使用步驟
羅氏LightCycler® 480 實時熒光定量PCR系統是實驗室中常用的一款中高通量qPCR平臺。以下是其標準的使用步驟流程，適用于絕大多數使用SYBR Green或TaqMan探針進行核酸擴增和定量分析的場景：
羅氏LightCycler® 480 使用步驟
一、實驗準備
核酸提取
提取DNA或RNA（如為RNA需進行反轉錄獲得cDNA）
評估濃度與純度（建議A260/A280介于1.8–2.0）
試劑準備
根據實驗方案選擇合適的qPCR試劑（如SYBR Green I Master、Probe Master）
準備引物/探針工作液，確保無氣泡、低溫避光保存
二、反應體系配置
標準反應體系（以20 µL體積為例）：
| 成分 | 體積（µL） |
|---|---|
| Master Mix | 10 |
| Forward Primer (10 µM) | 0.4 |
| Reverse Primer (10 µM) | 0.4 |
| 探針/染料（如適用） | 0.2 |
| 模板DNA/cDNA | 1–2 |
| 無RNAse水 | 補足至20 µL |
注意：
所有反應成分應在冰上配置；
引物濃度通常在0.2–0.5 µM之間；
若使用多重qPCR，請確保熒光通道互不干擾。
三、裝板與封板
將反應混合液分裝至96孔或384孔反應板中；
使用專用光學封板膜密封反應板；
輕壓封膜并離心去除氣泡（例如2000 rpm × 30秒）；
插入LightCycler® 480中指定托架位置。
四、程序設定（軟件操作）
在LightCycler® 480 Software中設置PCR程序，以下為常用的SYBR Green法設定模板：
預變性：95°C, 10 min
循環階段（40–45 cycles）：
變性：95°C, 10 sec
退火：60°C, 20 sec（具體溫度依引物而定）
延伸：72°C, 20 sec（有時與退火合并）
熔解曲線分析（如用SYBR Green）：
95°C, 5 sec
65°C–95°C逐步升溫，每步0.5°C，采集熒光
熒光采集通道：根據染料選擇通道（如FAM通道用于SYBR或FAM-TaqMan探針）
五、運行與監控
確認熱蓋溫度（一般為105°C）；
啟動程序運行，期間可實時觀察擴增曲線；
運行時間約為1.5–2小時（視程序設定而定）；
六、數據分析
擴增曲線查看：確認每孔反應特征，是否存在拖尾、背景信號；
Ct值判讀：導出或自動生成Ct結果表；
熔解曲線分析（SYBR Green）：判斷特異性與是否出現非特異擴增；
標準曲線法（如絕對定量）：生成曲線并計算拷貝數；
表達量分析（如相對定量）：使用ΔΔCt法比較表達差異；
七、數據導出與保存
可導出
.xls,.pdf,.xml等格式結果；保存完整項目用于追溯和后續分析；
建議同時備份至本地和實驗室服務器。
八、儀器清潔與維護
每次使用后清理反應板托盤；
定期進行光路校準與溫控驗證；
每月檢查熱蓋壓力與熒光通道響應；
若長期不使用，建議進行關機保護處理。