細胞CDK1/CYCLINB激酶活性熒光共振能量轉移法定量檢測試劑盒

產品說明書

主要用途

細胞CDK1/CYCLIN B激酶活性熒光共振能量轉移法（FRET）定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針EDANS供體和DABCYL受體雙重標記的多肽底物，在CDK1/CYCLIN B的磷酸化后，不能被位點特異性氨基肽酶切離，而發生熒光峰值的降低，即采用熒光共振能量轉移法來測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中CDK1/CYCLIN B激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，安全可靠。

技術背景

細胞周期素依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1；CDK1），又稱為細胞分裂周期蛋白2（cell division cycle2；CDC2）或p34cdk1，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其為高度進化保留的激酶復合物，成熟促進因子（maturation promoting factor；MRF）中的催化亞體，含有297氨基酸，與細胞周期素B結合，允許細胞由G2期進入有絲分裂期以及由G1期進入DNA合成期，達到調節細胞生長、DNA復制、細胞分裂等。其磷酸化目標序列為 GGGRSPGRRRRK。基于磷酸化多肽具有抗氨基肽酶切離的功能，通過熒光共振能量轉移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即傳遞激發狀態的能量由處于較短波長的供體（donor）到覆蓋供體波長的受體（acceptor），使得距離依賴性反應的供體的散發光子淬滅（quench），使用2個熒光探針EDANS供體和DABCYL受體作為FRET對，來標記的CDK1多肽底物的兩端，在氨基肽酶（aminopeptidase）的作用下，釋放出強烈熒光的EDANS；一旦底物受到CDK1的磷酸化（由ATP的γ－磷酸根到多肽上單一絲氨酸殘基分子上），底物將不能被位點特異性氨基肽酶切離，而無法釋放出EDANS，由此根據產物熒光強度（激發波長340nm，散發波長490nm）的降低，來定量測定細胞周期素依賴性激酶1的活性。細胞周期素依賴性激酶1反應系統為：

產品內容

保存方式

保存 清理液（Reagent A）和 裂解液（Reagent B）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃

冰箱里；底物液（Reagent D）和標準液（Reagent H）避免光照，有效保證6 月

用戶自備

CDK1/CYCLIN B 激酶：用于抑制劑篩選

磷酸化底物液（Reagent I）：用于測定樣品磷酸化程度的反應試劑

1.5 毫升離心管：用于標準樣品操作和樣品保存的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

黑色酶標板：用于反應和比色的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、樣品準備

1． 準備好 25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1 至5 X 106細胞）

2． 小心加入 xx 毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入 xx 毫升  清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進 4℃臺式離心機離心5 分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升  裂解液（Reagent B），充分混勻

10．轉移到預冷的1.5 毫升離心管

11．強力渦旋震蕩15 秒

12．置于冰槽里孵育30 分鐘

13．放進4℃微型臺式離心機離心5 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14．小心移取500 微升上清液到新的預冷的1.5 毫升離心管

15．移取10 微升進行蛋白定量檢測

16．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設定好熒光酶標儀（溫度為 25℃）：激發波長360nm，散發波長490nm，并置零

3． 準備好 5 個1.5 毫升離心管，標記為1 至5 號管

2

4． 加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到1號管

5． 分別加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到2至5號管

6． 移取xx微升 標準液（Reagent H）到1號管，混勻

7． 小心移取xx微升1號管稀釋的 標準液（Reagent H）到2號管，混勻

8． 小心移取xx微升2號管稀釋的 標準液（Reagent H）到3號管，混勻

9． 小心移取xx微升3號管稀釋的 標準液（Reagent H）到4號管，混勻

10．將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

三、熒光測定

（一）活性測定

1． 在96孔酶標板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品

2． 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到相應孔中

3． 分別加入xx微升 底物液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升上述配制的標準液或待測樣品（20微克純化酶或100微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 分別加入xx微升 反應液（Reagent E）

6． 輕輕搖動96孔酶標板30秒

7． 在室溫下孵育60分鐘

8． 分別加入xx微升 酶解液（Reagent F）

9． 輕輕搖動96孔酶標板30秒

10．在室溫下孵育30分鐘

11．分別加入xx微升 終止液（Reagent G）

12．即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）

13．活性計算：

1） 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位RFU；橫座標（X軸）為標準EDAN濃度（微摩爾/升）

2） 根據標準曲線計算樣品中所釋放的EDAN濃度

3） 實際活性計算：

[樣品EDAN濃度（微摩爾/升）X樣品稀釋倍數]÷ 1（小時；反應時間）]＝納摩爾EDAN/毫升/小時÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾EDAN/毫克/小時

（二）活性抑制測定（抑制劑篩選）

1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景、零抑制、*抑制和待測抑制劑樣品

2． 按下表加入試劑

3． 輕輕搖動96孔酶標板30秒

4． 在室溫下孵育60分鐘

5． 分別加入xx微升 酶解液（Reagent F）

6． 輕輕搖動96孔酶標板30秒

7． 在室溫下孵育30分鐘

8． 分別加xx微升 終止液（Reagent G）

9． 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）

10．抑制活性計算：

1）[（*抑制讀數－零抑制讀數）－（抑制劑樣品讀數－樣本背景讀數）]÷（*抑制讀數－零抑制讀數）＝實際抑制百分率

2）IC50：50％抑制率所需的抑制劑濃度

X（所需抑制劑濃度）＝（已知抑制劑樣品濃度÷實際抑制百分率）X 50％

3）直接構建抑制曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位RFU；橫座標（X軸）為已知抑制劑濃度

（三）磷酸化百分率測定

1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景、零磷酸化、*磷酸化和待測樣品

2． 按下表加入試劑

3． 輕輕搖動96孔酶標板30秒 4

4． 在室溫下孵育60分鐘

5． 分別加入xx微升 酶解液（Reagent F）

6． 輕輕搖動96孔酶標板30秒

7． 在室溫下孵育30分鐘

8． 分別加入xx微升 終止液（Reagent G）

9． 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）

10．磷酸化百分率計算：

[（*磷酸化讀數－零磷酸化讀數）－（樣品讀數－樣本背景讀數）]÷（*磷酸化讀數－零磷酸化讀數）＝樣品磷酸化百分率

注意事項

1． 本產品為25次操作，包括標準液

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，標準液測定只需1次

4． 樣品須澄清，至關重要

5． 孵育反應完成后即刻進行熒光測定

6． 熒光濾波器可以使用激發波長在340±30nm，散發波長490±30nm

7． 待測樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為20微克/20微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為100微克/20微升

8． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

9． 相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）越高，表明酶活性越低

10．需要 磷酸化底物液（Reagent I），須另外訂購

11．可以使用CDK1/CYCLIN B抑制劑（CGP74514A）作為抑制劑對照（IC50＝0.025微摩爾）或陰性對照

12．本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感