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維生素B1測定操作步驟
1樣品制備
樣品采集后用勻漿機打成勻漿于低溫冰箱中冷凍保存，用時將其解凍后混勻使用。干燥樣品要將其盡量粉碎后備用。
2提取
2.1稱取一定量試樣(估計其硫胺素含量約為10~30μg，一般稱取2~10g試樣)，置于100ml三角瓶中，加入50ml0.1mol/L或0.3mol/L鹽酸使其溶解，放入高壓鍋中加熱水解121℃30min，涼后取出。
2.2用2mol/L乙酸鈉調其pH值為4.5(以0.04%溴甲酚綠為外指示劑)。
2.3按每克樣品加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45~50℃溫箱過夜保溫(約16h)。
2.4涼至室溫，定容至100ml，然后混勻過濾，即為提取液。
3凈化
3.1用少許脫脂棉鋪于鹽基交換管的交換柱底部，加水將棉纖維中氣泡排出，再加約1g活性人造浮石使之達到交換柱的三分之一高度。保持鹽基交換管中液面始終高于活性人造浮石。
3.2用移液管加入提取液20~60ml(使通過活性人造浮石的硫胺素總量約為2~5μg)。
3.3加入約10ml熱蒸餾水沖洗交換柱，棄去洗液。如此重復三次。
3.4加入25%酸性氯化鉀(溫度為90℃左右)20ml，收集此液于25ml刻度試管內，涼至室溫，用25%酸性氯化鉀定容至25ml，即為樣品凈化液。
3.5重復上述操作，將20ml硫胺素標準使用液加入鹽基交換管以代替樣品提取液，即得到標準凈化液。
4氧化
4.1將5ml樣品凈化液分別加入A、B兩個反應瓶。
4.2在避光條件下將3ml15%氫氧化鈉加入反應瓶A，將3ml堿性鐵氰化鉀溶液加入反應瓶B，振搖約15s，然后加入10ml正丁醇；將A、B兩個反應瓶同時用力振搖1.5min。
4.3重復上述操作，用標準凈化液代替樣品凈化液。
4.4靜置分層后吸去下層堿性溶液，加入2~3g無水硫酸鈉使溶液脫水。
5測定
5.1熒光測定條件：
激發波長365nm；發射波長435nm；激發波狹縫5nm；發射波狹縫5nm。
5.2依次測定下列熒光強度：
a.樣品空白熒光強度(樣品反應瓶A)；
b.標準空白熒光強度(標準反應瓶A)；
c.樣品熒光強度(樣品反應瓶B)；
d.標準熒光強度(標準反應瓶B)；
維生素B1測定的注意事項
1、加熱酸性氯化鉀而不使其沸的原因是熱氯化鉀濾速較快，而不沸則是使其不至因過飽和而在洗滌中結晶析出阻塞交換柱。被洗下的硫胺素在酸性氯化鉀中極其穩定，可保存一周以上。
2、硫胺素在堿性環境中被鐵氰化鉀氧化成噻嘧色素，振搖15s是使其充分反應，這期間應保證黃色不退證明鐵氰化鉀量充足不被其它還原性雜質耗盡，而強堿又可破壞硫胺素，所以除加入堿性鐵氰化鉀時邊搖勻邊加入外，其加入量一定不能過多，否則硫胺素被破壞。
3、對每個樣品所加試劑的次序、快慢、振搖時間等都必須盡量一致，尤其是用正丁醇提取噻嘧色素時必須保證準確振搖90s。
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