簡介

在生物化學領域中，生物材料的熱學性能研究是材料分析的重要組成部分。而熔解溫度（T_M）是生物材料中應用zui廣泛的熱學性能。生物材料由許多化學鍵組成，隨著溫度的升高，材料內能增加同時化學鍵斷裂。這種因化學鍵斷裂而導致生物材料結構改變的現象被稱作熱變性。此外，zui活躍時的變性溫度被稱為熔解溫度。熔解溫度是用于表征材料穩定性的指標之一。寡核苷酸是一種遺傳物質，由多組堿基構成。寡核苷酸可以很容易地和它們的互補對鏈接，所以常用來作為探針確定DNA或RNA的結構，經常用于基因芯片、電泳、熒光雜交等過程中。如圖1所示，我們將Alexa Fluor^® 488 熒光探針標記在寡核苷酸的5´  端部，將Alexa Fluor^® 532 熒光探針連接在另一端。

本實驗采用Thermo Fisher公司的lumina熒光分光光度計配備 Peltier 溫控系統（圖2）對不同溫度下的熒光性能進行了測量。Peltier溫控系統可快速地對溫度進行調節，溫度范圍可控制在-10℃到100℃。該系統有樣品除霜功能、磁力攪拌功能和溫控功能。本研究采用 Lumina 和 Peltier系統，結合熒光標記，研究了寡核苷酸熒光強度與溫度的關系。zui終根據一階導數分析熔點曲線并計算出了T_M 值。

圖 2：Peltier 系統配件（單池池架（a）、4 聯池池架（b）、Peltier 控制模塊（c））

試劑和儀器

1.Lumina熒光分光光度計 

2.Peltier 控制模塊、單池池架

3.供體寡核苷酸5´  – (Alexa 488) – ACCGTGAGCA – 3´

4.受體寡核苷酸

5´ – (Alexa 532) – TGCTCACGGT – 3´ 5.Tris-EDTA 緩沖液（pH 8.0）

6.NaCl（ACS 試劑，≥99.0%）

7.10ml 塑料管

8.熒光比色皿

實驗步驟

1.添加 10ml 的 Tris-EDTA 緩沖液（pH 8.0）到兩根塑料管中，形成濃度分別為172mM（供體）190mM（受體）的NaCl溶液。

2.在上述緩沖液中溶解供體/受體寡核苷酸，使濃度變為900nM。

3.混合已制備的供體試劑和受體試劑，然后在室溫下培養5分鐘。

4.將Peltier系統安裝在 Lumina上。5.打開Luminous的Thermal軟件，如圖3輸入預定參數。使用軟件（Excel^®, Origin^®等）根據供體各測量點數據計算一階導數，并在測量后查看T_M 值。

儀器參數

圖3：Thermal軟件測量條件

實驗結果

FRET 現象是供體到受體的一種能量轉移現象，這是由于熒光物質受熱前熒光探針間距離較短造成的。因

此，在供體激發波長519nm處發出較弱的熒光，在受體的激發波長553nm處發出較強的熒光。另一方面，

隨著受熱產生的熱變性現象，與FRET現象相反。換句話說，熒光在519nm時較強，而在553nm時較弱（圖4）。

圖4：受熱前（左圖，25℃）、受熱后（右圖，55℃）熱變性熒光強度如圖5所示，我們繪制了供體、受體熒光強度與溫度的關系。可以確認，供體和受體上發生的熒光強度逆轉的情況是由于 FRET 現象消失導致的。

圖5：供體、受體熒光強度與溫度的關系

目前有多種方法可以確定T_M 值，本實驗中我們通過一階導數的峰值來確定T_M 值。本次試驗所用寡核苷酸的TM 值為49℃。（圖6）

圖6：熒光強度隨溫度而改變

實驗結論

本研究中，使用Thermo Fisher公司Lumina熒光分光光度計和Peltier 溫控系統，研究了溫度變化對寡核苷酸熒光強度的影響。此外，根據實驗數據計算出代表材料安全性的TM 值。