一、原理與意義

    通過(guò)抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象,對(duì)樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ABC-ELISA法,用抗小鼠TNF-a單抗包被于酶標(biāo)板上,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的TNF-a與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗小鼠TNF-a抗體,形成免疫復(fù)合物連接在板上,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin)與生物素結(jié)合,加入酶底物鄰苯二胺(OPD),出現(xiàn)黃色,加終止液濃硫酸,顏色變深,在492nm處測(cè)OD值,TNF-a濃度與OD值成正比,可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中TNF-a濃度。它是樣品中蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的定性和定量方法。

二、試劑盒的組成

    96/48微孔板(1塊,已包被抗小鼠TNF-a單抗)、樣品稀釋液(1瓶)、抗體工作液(1瓶)、酶標(biāo)抗體工作液(1瓶)、底物稀釋液(1瓶)、終止液(1瓶)、洗滌液(20×,1瓶)、標(biāo)準(zhǔn)品(2000 pg/ml,2管,凍干粉)、OPD片(3片)、坐標(biāo)紙(1張)。

四、操作步驟

1、設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)孔8孔(根據(jù)樣品蛋白濃度可調(diào)整為6孔),每孔中先各加入樣品稀釋液100 ul,孔再加標(biāo)準(zhǔn)品100 ul,混勻后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋至第7孔,后,從第7孔中吸出100 ul棄去,使之體積均為100 ul。第8孔為空白對(duì)照。

2、加樣:待測(cè)樣品孔中每孔各加入待測(cè)樣品100ul。

3、將反應(yīng)板置于37 ℃×120 min。

4、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次,向?yàn)V紙上扣干。

5、每孔中加入抗體工作液50ul。

6、將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃×60 min。

7、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4~6次,向?yàn)V紙上扣干。

8、每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。

9、將反應(yīng)板置于37 ℃ 120 min。

10、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4~6次,向?yàn)V紙上扣干。

11、每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 ℃暗處反應(yīng)5~10 min。

12、每孔中加入50ul終止液混勻。

13、用酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)吸光值。