1.定義

免疫PCR（immuno polymerase chain reaction,IM-PCR）是1992年Sano建立的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術。該技術把抗原抗體反應的高特異性和聚合酶鏈反應的高敏感性有機結合起來，利用抗原抗體反應的特異性和PCR擴增反應的*靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術。其本質是一種以PCR擴增一段DNA報告分子代替酶反應來放大抗原抗體結合率的一種改良型ELISA。

用抗體檢測抗原是免疫學的zui基本方法，用酶或同位素標記抗體可使檢測的敏感性提高，常用的定量檢測方法ELISA和RIA均基于標記分子可以使檢測的信號增強。免疫PCR是在ELISA的基礎上建立起來的新方法，用PCR擴增代替ELISA的酶催化底物顯色。PCR具有很強的放大能力，其可以定量地檢測DNA和RNA,具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結合的特異抗體通過連接分子與DNA結合，再經PCR擴增，由此定量檢測抗原使敏感性高于ELISA和RIA。

2.基本原理

免疫PCR是用一段已知DNA分子標記抗體作為探針，用此探針與待測抗原反應，PCR擴增粘附在抗原抗體復合物上的這段DNA分子，電泳定性，根據特異性PCR產物的有無，來判斷待測抗原是否存在。免疫PCR是迄今zui敏感的一種抗原檢測方法，理論上可以檢測單個抗原分子，但實踐中它的敏感性受許多因素的影響，如連接分子、顯示系統的選擇、DNA報告分子的濃度、PCR循環次數等。目前，國內外報道免疫PCR的敏感性一般比現行的ELISA法高102-108倍。由于PCR產物在抗原量未達到飽和前與抗原抗體復合物的量成正比，因此免疫PCR還可用于抗原的半定量試驗。

免疫PCR主要由兩個部分組成：

*部分的免疫反應類似于普通的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的測定過程；

第二部分即通常的PCR檢測，抗原分子的量zui終由PCR產物的多少來反映。

*步中，首先用待測抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相應的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結合形成抗原抗體復合物，蛋白A-鏈親合素（Protein A-Streptavidin）嵌合體（重組融合蛋白）中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復合物中的抗體IgG結合，而鏈親合素部分可與生物素化的pUC19（質粒DNA） （Biotin-pUC19）中的生物素反應，從而將特定的DNA間接吸附于固相。

接下來，就是第二步中的PCR過程，*步中吸附于固相的pUC19質粒DNA在相應的引物存在下，可經PCR在幾小時內而放大數百萬倍，PCR產物的多少與固相上抗原的量成正比。

PCR由：①待測抗原；②生物素化抗體；③親和素（連接分子）；④生物素化DNA；⑤PCR擴增五部分構成。

（1）待檢抗原

被檢測的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過程與ELISA試驗是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應用目前介紹的免疫PCR方法進行檢測，需要對免疫PCR進行改進，以便能夠檢測吸附性差的抗原。免疫PCR的后續過程需PCR擴增，目前有些方法應用的固相板或管是特殊用于免疫PCR,并且有些PCR僅可以直接用微量板進行擴增，這樣可以簡化實驗過程和提高檢測的性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測微量抗原。

（2）特異抗體

免疫PCR中的特異抗體是對應于待檢抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親合力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單克隆抗體，這個抗體常采用生物素標記，通過親和素再結合DNA。

（3）連接分子

連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。目前介紹的方法中均是通過生物素與親和素系統使特異抗體與DNA連接，生物素和親和素作為免疫PCR的連接分子在連接方式上有許多差異。Sano報道PCR時用的是重組葡萄球菌A蛋白-親和素嵌合蛋白（SPA-親和素）。其具有結合IgG和生物素的兩個位點，因此可以將IgG與生物素化的DNA連接成復合物。由于重組的SPA-親和素沒有商品試劑，且SPA不但可以結合特異抗體的IgG,而且還可以與樣品中吸附于固相的無關IgG結合，特別是檢測的抗原就是某種IgG，因此，Ruzicke認為Sano的免疫PCR本底高和特異性差。Ruzicke用商品化的親和素系統試劑建立了一種免疫PCR，這種方法是先將親和素與生物素化的DNA預結合成復合物，然后再與結合固相的特異性抗體結合，這種方法存在的問題是親和素與生物素化的DNA分子預結合時二者的分子比例并不是等同的，一個親和素分子可以結合4個分子生物素，因此在預結合時生物素化的DNA分子不能過多，否則DNA分子上的生物素將親和素*飽和，親和素再無結合生物素化抗體的能力；但在低飽和生物素化DNA時，親和素結合的生物素化DNA存在許多種類的復合物，甚至還有游離的親和素，只有部分結合生物素化DNA的親和素才能起到連接分子的作用，因此，這樣預結合的親和素和生物素化DNA是一均質性很差的混合物。雖然預結合的復合物可以減少測試過程中的1次孵育和沖洗，但是這樣的復合物作為連接分子必然導致敏感性低和誤差大，并且每次制備的連接分子均有差異，從而導致重復性差。

Hong zhou等建立了一種免疫PCR方法，連接分子是鏈親和素，在連接抗體和DNA時是以游離的方式加入，這樣鏈親和素先與生物素化抗體結合，沖洗后，再加入生物素化的DNA.這個方法雖然多了1次孵育和沖洗過程，但具有較好的敏感性和重復性。

（4）DNA和PCR系統

免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是應用了PCR強大的擴增能力。免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA,但要保證DNA的純度，且有較好的均質性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA.一般可選用質粒DNA或PCR產物等。DNA的生物素化是用生物素標記的dATP或dUTP通過DNA聚合酶標記在DNA分子上，一般是一個分子DNA標記兩個生物素，標記率可達。生物素化的DNA用量需預先選定，過多易出現非特異結合而引起本底過高，過低將導致敏感性低和出現不同濃度抗原得出同樣結果的飽和現象。

免疫PCR的PCR擴增系統與一般PCR一樣，主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相進行抗原抗體反應，同時又需要對固相結合的DNA進行擴增，因此，免疫PCR固相的選擇應根據具體情況確定。用微量板作為固相必須有配套的PCR儀，以使可以用微量板直接擴增，否則需要用PCR反應管作為固相擴增后的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，根據PCR產物的大小選擇兩種凝膠的濃度。電泳后凝膠經染色和拍照記錄結果，再檢測底片上PCR產物的光密度，并與標準品比較就可以得出待檢抗原量。

提示：本文免疫PCR的基本原理屬于PCR技術文章，主要介紹免疫PCR方面的知識，內容僅供學習交流與參考

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