種屬

人

細胞用途

僅供科研使用

生長特性

貼壁

培養

培養基：90%DMEM（高糖）+10%FBS

溫度：37℃     氣相：95%空氣，5%二氧化碳

細胞特性

1）  來源：體細胞融合細胞

2）  形態：內皮細胞樣，貼壁生長

3）  含量：>1x10⁶ 個/mL

4）  污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

5）  規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

細胞培養步驟

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.      棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.      加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3.      按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4.      收到細胞后傳代推薦將細胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續傳代根據實際情況按1:2到1:5的比例進行。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為例；

1     細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml*培養基終止消化，可使用血球計數板計數。

2     1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X10⁶個細胞凍存。

3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

保存

凍存條件：90%*培養液+10%DMSO

(備注：建議使用本公司的冷凍液（H-W-100），用4度保存的冷凍液直接重懸細胞，不能預熱后使用。)

保存條件：液氮存儲

常見問題及解決方案

1.培養瓶有破裂，培養液有漏液：細胞極大可能會污染，所以我們會及時安排幫老師解決。

2.收到細胞后盡快更換為含 10%血清的新鮮培養基，如因特殊情況需要繼續使用原瓶培養基，請在原瓶培養基中額外添加 10%的血清（原瓶培養基的繼續使用時間長不宜超過 72 小時）

3.細胞漂?。号囵B瓶不開封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養箱。1-2小時后觀察，如細胞大部分又貼回瓶底，表明細胞活力正常，剩余漂浮的細胞可以去掉，留8-10ml培養液培養觀察，細胞生長至匯合度80%，進行消化傳代；如細胞還是不貼壁，將細胞離心收集轉到新培養瓶，原培養瓶加部分培養液繼續培養，中間注意觀察，我們的技術人員會一直跟蹤指導，直到問題解決。