儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入Thermo賽默飛液相色譜柱內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時, 經過反復多次的吸附- 解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀。當色譜系統中需使用pH 值大于8 的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等，當需使用pH值小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，或有機-無機雜化填充劑等。
 
    如果堿性化合物的極性太強，或堿性太強；可以選擇Thermo賽默飛液相色譜柱在高pH值檢測或者選用HILIC色譜柱，硅膠柱在反相條件下使用，這也是很經典的檢測堿性樣品的方法，選擇強離子交換柱，也有使用C18+強陰離子對試劑或強陰離子交換色譜柱。開孔的填料多了個類似分子篩功能，所以選擇孔徑一定要關注分子量，蛋白，一般都需要在160A以上，在120A左右，一般快速柱孔徑都很小，可以縮短樣品路徑。